脂肪因子脂聯(lián)素、瘦素在退行性瓣膜中的表達(dá)特點(diǎn)

陳集敏，謝霆，陳新忠

(1.海南省人民醫(yī)院病理科，海南?？?570311；2.海南省人民醫(yī)院心臟外科，海南?？?570311；3.華中科技大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院心臟外科，湖北武漢 430022)

·臨床病理·

脂肪因子脂聯(lián)素、瘦素在退行性瓣膜中的表達(dá)特點(diǎn)

陳集敏1，謝霆2，陳新忠3

(1.海南省人民醫(yī)院病理科，海南?？?570311；2.海南省人民醫(yī)院心臟外科，海南?？?570311；3.華中科技大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院心臟外科，湖北武漢 430022)

目的探討脂肪因子脂聯(lián)素、瘦素在退行性主動(dòng)脈瓣的組織表達(dá)特點(diǎn)。方法收集2012年10月至2013年10月在海南省人民醫(yī)院心外科因退行性主動(dòng)脈瓣疾病行手術(shù)切除的主動(dòng)脈瓣標(biāo)本30例[男17例，女13例，年齡(55±6)歲]，因夾層動(dòng)脈瘤行Bentall手術(shù)切除正常主動(dòng)脈瓣標(biāo)本7例[男性4例，女性3例，年齡(41±8)歲]。經(jīng)HE和免疫組織化學(xué)染色，觀察退行性主動(dòng)脈瓣的組織病理學(xué)改變，了解脂肪因子脂聯(lián)素、瘦素在退行性主動(dòng)脈瓣的表達(dá)特點(diǎn)。結(jié)果HE染色顯示，與正常瓣膜比較，損傷的主動(dòng)脈層內(nèi)皮下可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞聚集、纖維組織增生和結(jié)節(jié)性鈣化灶形成，退行性主動(dòng)脈瓣的厚度不同程度增加[重度(2.80±1.18)mm、中度(2.10±0.09)mm、輕度(0.92±0.13)mm、正常(0.75±0.07)mm]，進(jìn)一步的分析顯示膠原層增厚明顯，松質(zhì)層厚度降低，而心室層無(wú)明顯改變，免疫組織化學(xué)染色顯示脂聯(lián)素在正常瓣膜和退行性主動(dòng)脈瓣中無(wú)表達(dá)；瘦素在正常瓣膜無(wú)表達(dá)，而在退行性主動(dòng)脈瓣見(jiàn)新生血管以及血管周?chē)斜磉_(dá)。結(jié)論退行性主動(dòng)脈瓣病變中瘦素表達(dá)增加。

退行性主動(dòng)脈瓣病變；脂肪因子；脂聯(lián)素；瘦素

近年研究發(fā)現(xiàn)，脂肪組織不僅是一個(gè)能量?jī)?chǔ)存器官，而且是一個(gè)具有內(nèi)分泌功能的組織，它可以分泌多種調(diào)控機(jī)體代謝和能量平衡的活性因子，包括瘦素、腫瘤壞死因子、纖溶酶原激活物抑制劑、抵抗素、白介素、脂聯(lián)素等。其中瘦素是最早發(fā)現(xiàn)的脂肪因子，瘦素能調(diào)節(jié)體重和促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。脂聯(lián)素是脂肪組織特異性分泌的具有類(lèi)似膠原結(jié)構(gòu)的蛋白，被認(rèn)為是胰島素抵抗和動(dòng)脈粥樣硬化的保護(hù)性因子[1]。目前研究認(rèn)為退行性主動(dòng)脈瓣疾病的病理機(jī)制類(lèi)似于主動(dòng)脈粥樣硬化[2]，雖然證實(shí)脂肪因子參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，但目前尚不清楚脂肪因子脂聯(lián)素、瘦素是否參與退行性主動(dòng)脈瓣的病理過(guò)程。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2012年10月至2013年10月在我院因退行性主動(dòng)脈瓣疾病行手術(shù)切除的主動(dòng)脈瓣(病變瓣膜組)標(biāo)本30例[男性17例，女性13例，年齡(55±6)歲]，因夾層動(dòng)脈瘤行Bentall手術(shù)切除的正常主動(dòng)脈瓣(正常瓣膜作為對(duì)照組)標(biāo)本7例[男性4例，女性3例，年齡(41±8)歲]。排除標(biāo)準(zhǔn)：甲狀旁腺疾病和腎功能衰竭等影響鈣磷代謝以及炎癥所致C反應(yīng)蛋白和血沉升高的患者。所有組織標(biāo)本均經(jīng)患者及家屬知情同意后采集，研究方案獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法本實(shí)驗(yàn)隨機(jī)選取3個(gè)正常瓣膜和10個(gè)異常的瓣膜，在中部進(jìn)行測(cè)量，所有標(biāo)本選取最大直徑進(jìn)行測(cè)量，每一例標(biāo)本分別測(cè)量心室層、松質(zhì)層、膠原層厚度及瓣膜總厚度。正常瓣膜為一組，異常瓣膜按照瓣膜增厚呈度分為低、中、高三組，對(duì)這四組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，比較各組瓣膜不同層的差異。

1.2.1 主動(dòng)脈瓣膜的制片與觀察標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、5 μm連續(xù)切片。為了更好地保存抗原，在切片前標(biāo)本不行脫鈣處理。常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察瓣膜的厚度、組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞的組成、鈣化的部位以及鈣化周?chē)母淖儭?/p>

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色兔抗人脂聯(lián)素及瘦素多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，按1:200稀釋?zhuān)捎肞V-9000通用型二步法試劑盒。具體操作按試劑盒說(shuō)明操作，結(jié)果判讀以出現(xiàn)棕黃色且高出背景色為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS19.0版本統(tǒng)計(jì)軟件處理和分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 瓣膜組織肉眼觀察正常的瓣膜呈半透明狀，柔韌性好。病變的瓣膜可見(jiàn)不同程度的鈣化，表現(xiàn)為瓣口的狹窄和瓣膜明顯增厚、質(zhì)硬。

2.2 HE染色結(jié)果與正常瓣膜比較[(0.75± 0.07)mm]，損傷的主動(dòng)脈層內(nèi)皮下可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞聚集、纖維組織增生和結(jié)節(jié)性鈣化灶形成，退行性主動(dòng)脈瓣的厚度不同程度增加[重度(2.80±1.18)mm，中度(2.10±0.09)mm，輕度(0.92±0.13)mm]，重度、中度、輕度瓣膜狹窄患者分別與正常瓣膜厚度比較，重度瓣膜狹窄t值=22.60、P＜0.001(雙側(cè))；中度瓣膜狹窄t值= 11.77、P＜0.001(雙側(cè))；輕度瓣膜狹窄t值=3.13、P= 0.017(雙側(cè))，其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步的分析顯示膠原層增厚明顯，松質(zhì)層厚度降低，而心室層無(wú)明顯改變，見(jiàn)表1。

表1 正常瓣膜和退行性主動(dòng)脈瓣組織厚度比較(mm，±s)

表1 正常瓣膜和退行性主動(dòng)脈瓣組織厚度比較(mm，±s)

瓣膜心室層松質(zhì)層膠原層瓣膜正常(n=3)輕度增厚(n=3)中度增厚(n=3)重度增厚(n=4) 0.20±0.09 0.18±0.06 0.21±0.07 0.19±0.08 0.31±0.12 0.27±0.10 0.11±0.06 0.01±0.01 0.24±0.12 0.27±0.09 0.89±0.12 1.34±0.15 0.75±0.07 0.92±0.13 2.10±0.09 2.80±1.18

2.3 脂聯(lián)素或瘦素表達(dá)特點(diǎn)免疫組織化學(xué)染色顯示，脂聯(lián)素在正常瓣膜和退行性主動(dòng)脈瓣中無(wú)表達(dá)；瘦素在正常瓣膜無(wú)表達(dá)，而在退行性主動(dòng)脈瓣見(jiàn)新生血管以及血管周?chē)斜磉_(dá)，見(jiàn)圖1。

圖1 正常和病變瓣膜脂聯(lián)素和瘦素免疫組織化學(xué)染色

3 討論

正常瓣膜主要由5層構(gòu)成，依次為瓣膜主動(dòng)脈面的內(nèi)皮層、富含膠原纖維的膠原層、致密基質(zhì)較少并排列疏松的間質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成的松質(zhì)層、有明顯彈力纖維的心室層、瓣膜心室面的內(nèi)皮層。正常的瓣膜中纖維排列整齊，無(wú)血管、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)[3]，退行性主動(dòng)脈瓣較正常瓣膜增厚，損傷的主動(dòng)脈瓣內(nèi)皮下可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞聚集，血管生成，在炎癥細(xì)胞下方可見(jiàn)結(jié)節(jié)性鈣化灶存在，由于炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和鈣化結(jié)節(jié)的擠壓效應(yīng)導(dǎo)致鈣化下面的松質(zhì)層消失，而炎癥細(xì)胞刺激纖維增生導(dǎo)致病變瓣膜纖維增厚紊亂。

目前對(duì)退行性主動(dòng)脈瓣疾病的研究顯示，其致病機(jī)制類(lèi)似于主動(dòng)脈粥樣硬化，在血流動(dòng)力學(xué)沖擊下瓣膜正常的結(jié)構(gòu)受到破壞，導(dǎo)致主動(dòng)脈瓣內(nèi)皮層以及膠原纖維損傷、血脂積聚、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、泡沫細(xì)胞和血管生成，最終瓣膜鈣化[2]。但目前脂肪因子和退行性主動(dòng)脈瓣鈣化之間的研究較少，尚不清楚脂肪因子是否參與了退行性主動(dòng)脈瓣病變。既往脂肪組織被認(rèn)為是一個(gè)無(wú)效的身體車(chē)廂，只作為儲(chǔ)存能量。近年來(lái)越來(lái)越多的數(shù)據(jù)表明，脂肪組織是重要的內(nèi)分泌和旁分泌器官，能夠產(chǎn)生多種酶、激素和生長(zhǎng)因子(統(tǒng)稱(chēng)為脂肪因子)。研究表明，脂肪因子除了調(diào)節(jié)影響葡萄糖、脂肪代謝，還與肥胖和代謝性疾病有關(guān)，如脂肪代謝異常密切相關(guān)的動(dòng)脈粥樣硬化，目前呈幾何級(jí)增長(zhǎng)的文獻(xiàn)顯示，脂肪因子影響了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，調(diào)節(jié)血管中內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、泡沫細(xì)胞、炎癥細(xì)胞的活性[1，4]。

脂聯(lián)素是經(jīng)典的脂肪因子，在動(dòng)物試驗(yàn)中通過(guò)藥理或遺傳方法升高血漿脂聯(lián)素，能夠減輕肥胖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮功能障礙與高血壓，還可以防止動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗塞和糖尿病性心肌病。此外，脂聯(lián)素是保護(hù)心血管健康的血管擴(kuò)張劑，在心臟和血管細(xì)胞起抗凋亡，抗炎和抗氧化活性[5]，而本實(shí)驗(yàn)退行性主動(dòng)脈瓣并未發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素表達(dá)，且在正常瓣膜中也未見(jiàn)表達(dá)，這提示動(dòng)脈粥樣硬化可能與鈣化性主動(dòng)脈瓣存在不同的機(jī)制。

血液中脂肪因子瘦素升高是心肌梗死的危險(xiǎn)因子[6]，它與動(dòng)脈粥樣斑塊里的C反應(yīng)蛋白和可溶性IL-6受體正相關(guān)[7]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察到瘦素導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞增生和基質(zhì)金屬蛋白酶2產(chǎn)生，在動(dòng)脈粥樣硬化晚期促進(jìn)粥樣斑塊的破裂[8-10]；瘦素還可以促纖維化細(xì)胞因子分泌進(jìn)而導(dǎo)致血管生成[11]，增加人和小鼠巨噬細(xì)胞分泌促動(dòng)脈粥樣硬化的脂蛋白脂肪酶[12]，加劇血小板聚集[13]，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞C反應(yīng)蛋白表達(dá)[14]。在現(xiàn)有的研究中認(rèn)為瘦素促進(jìn)了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)病理標(biāo)本檢查發(fā)現(xiàn)，在正常瓣膜未見(jiàn)瘦素表達(dá)，而鈣化瓣膜出現(xiàn)瘦素的表達(dá)，表明瘦素參與了瓣膜鈣化的發(fā)生發(fā)展，同時(shí)實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)瘦素主要在新生血管以及血管周?chē)磉_(dá)，提示退行性主動(dòng)脈瓣中的瘦素可能來(lái)源于血液中。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，特定的脂肪因子與退行性瓣膜病變發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，為了解退行性瓣膜病變的機(jī)制研究提供了新的視角，也為以后的診斷治療提供了可能的理論依據(jù)。

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Expression characteristics of adiponectin and leptin in degenerative valve.

CHEN Ji-min1,XIE Ting2,CHEN Xin-zhong3.1.Department of Pathology,People's Hospital of Hainan Province,Haikou 570311,Hainan,CHINA;2. Department of Cardiac Surgery,People's Hospital of Hainan Province,Haikou 570311,Hainan,CHINA;3.Department of Cardiac Surgery,Union Hospital Affiliated to Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430022,Hubei,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression of adiponectin and leptin in degenerative aortic valve. MethodsThe aortic valve specimens from October 2012 to October 2013 were collected in cardiac surgery department of People's Hospital of Hainan Provincial,which included 30 cases of specimens removed from degenerative aortic valve disease[17 cases of males,13 cases of females,aged(55±6)years old]and 7 cases of normal aortic valve specimens with dissecting aneurysm underwent Bentall operation resection[4 cases of males,3 cases of females,aged(41±8)years old]. And then the histopathological changes of degenerative aortic valve were observed by HE and immunohistochemical staining to study the expression characteristics of adiponectin and leptin.ResultsBy HE staining,compared with the normal valve,collection of amount of inflammatory cells,fibrous tissue hyperplasia and nodular calcification in injury endothelium of aortic layer were noted,and the thickness of degenerative aortic valve increased in varying degrees[severe (2.80±1.18)mm,moderate(2.10±0.09)mm,mild(0.92±0.13)mm,normal(0.75±0.07)mm].Further analysis showed a increase in the thickness of collagen layer,and a decrease in the thickness of trabecular layer,with no obvious change in the ventricular layer.By immunohistochemical staining,there was no expression of adiponectin in normal and degenerative aortic valve and no expression of leptin in normal valve,but the expression of leptin could be observed in and around new vessels of the degenerative aortic valve.ConclusionThe expression of leptin increases in degenerative aortic valve.

Degenerative aortic valve disease;Adipokines;Adiponectin;Leptin

R36

C

1003—6350(2014)16—2455—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.16.0958

2014-04-04)

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81270265）；海南省衛(wèi)生廳基金（編號(hào)：2012-07）

謝霆。E-mail：masterxieting@hotmail.com