D-CIK治療抑制進展期乳腺癌中循環(huán)腫瘤細胞的初步研究

馬磊，伍思培，鄧旭斌，金川，陸勤，劉曉燕，陳文晟，鄒青峰

（1.廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院內(nèi)三科廣州醫(yī)科大學腫瘤研究所，廣東 廣州 510095；2.廣東省人民醫(yī)院肺癌研究所，廣東 廣州 510080）

·論著·

D-CIK治療抑制進展期乳腺癌中循環(huán)腫瘤細胞的初步研究

馬磊1，伍思培2，鄧旭斌1，金川1，陸勤1，劉曉燕1，陳文晟1，鄒青峰1

（1.廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院內(nèi)三科廣州醫(yī)科大學腫瘤研究所，廣東 廣州 510095；2.廣東省人民醫(yī)院肺癌研究所，廣東 廣州 510080）

目的探討D-CIK治療對進展期乳腺癌外周血中循環(huán)腫瘤細胞數(shù)的變化情況及意義。方法采用Cellsearch檢測系統(tǒng)對32例明確診斷為進展期乳腺癌患者分別在CIK細胞回輸治療前后檢測外周血中循環(huán)腫瘤細胞數(shù)目變化情況，同時觀察治療過程中患者的相關(guān)不良反應。結(jié)果患者接受D-CIK治療后，循環(huán)腫瘤細胞的數(shù)目明顯減少，由治療前的5～18個/7.5 ml減少為治療后的2～11個/7.5 ml，兩者差異具有統(tǒng)計學的意義(P＜0.05)。治療過程中未見明顯不良反應。結(jié)論D-CIK治療可明顯降低患者外周血中循環(huán)腫瘤細胞的數(shù)目。

D-CIK；乳腺癌；循環(huán)腫瘤細胞

乳腺癌是危害人類健康的高發(fā)惡性腫瘤，不論是在發(fā)達國家還是在我國，均為女性最常見的惡性腫瘤類型。在我國目前乳腺癌的發(fā)病率為41.64/10萬，死亡率為9.63/10萬[1]；在美國2013年一共有232 340例新發(fā)乳腺癌病例，39 620例死亡病例[2]。雖然隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，尤其是早期檢測手段的實施和整體治療方案的更新，總體死亡率在近年來呈現(xiàn)進行性下降趨勢，但是對于伴有復發(fā)和轉(zhuǎn)移的腫瘤患者，生存狀況并沒有得到根本的改善。腫瘤一旦發(fā)生復發(fā)轉(zhuǎn)移，疾病將很難治愈，并最終導致絕大多數(shù)死亡[3]。

腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個包含多個步驟的復雜病理過程，包括腫瘤細胞的脫落、穿透基底膜、進入循環(huán)系統(tǒng)、繼發(fā)部位克隆形成并最終形成臨床可見的轉(zhuǎn)移瘤。其中腫瘤細胞從癌癥原發(fā)部位脫落，通過血管或淋巴系統(tǒng)進入血液循環(huán)系統(tǒng)是整個轉(zhuǎn)移過程中的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前研究證實，在腫瘤轉(zhuǎn)移的過程中，可以在患者的外周血中檢測到循環(huán)腫瘤細胞(Circulating tumor cells，CTCs)。在多種實體瘤中，CTCs可以反映腫瘤負荷，預測疾病發(fā)展，協(xié)助治療決策，比傳統(tǒng)影像學標準更為準確和靈敏，重復性更佳。因而它的診斷和治療價值以及在轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究中的作用越來越受到科學家們的重視[4]。因為CTCs經(jīng)常保持在未分化的狀態(tài)，甚至有些保持在干細胞的狀態(tài)，因此對常規(guī)的化療和靶向治療并不敏感。如何發(fā)展出特異性靶向CTCs的治療手段，減少或者消除外周循環(huán)中CTCs的含量，阻滯腫瘤轉(zhuǎn)移進程，最終降低腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生率，提高最終治療效果，延長患者總體生存時間具有重要的臨床意義[5]。本次研究中，筆者試圖采用Cellsearch檢測系統(tǒng)檢測D-CIK治療前后患者外周血循環(huán)中CTCs數(shù)量的變化，初步探討D-CIK細胞免疫療法對CTCs的抑制作用。

1 資料與方法

1.1 入組標準經(jīng)過病理學或細胞學證實的乳腺癌患者；年齡≤75歲；既往曾經(jīng)使用過包括手術(shù)及放化療在內(nèi)的綜合治療，均有客觀臨床觀察指標；末次放化療結(jié)束至少1個月，近1個月內(nèi)未作過其他抗腫瘤治療；無腦轉(zhuǎn)移及嚴重心功能不全；肝腎功能及血象基本正常，KPS＞70分，預計生存3個月以上；所有患者均簽署書面知情同意書。

1.2 臨床資料共計55例2012年6月至2014年2月于我院門診及住院的接受免疫D-CIK治療晚期乳腺癌患者進行了CTCs檢測。其中32例患者在治療前檢測中CTCs檢出率為58.2%。檢測到CTCs的32例患者全部納入到本次研究，見表1。

表1 32例患者的臨床資料[例（%）]

1.3 研究方法

1.3.1 D-CIK細胞體外擴增與回輸整個操作均在本單位生物層流室完成。首先采集患者外周血100 ml，使用淋巴細胞分離液(Ficoll)分離和收集單個核細胞。將細胞接種在1640完全培養(yǎng)基中，細胞終濃度大于106/ml。經(jīng)過37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后收集懸浮細胞作為效應T細胞培養(yǎng)，貼壁細胞為DC細胞。后續(xù)培養(yǎng)第3天加入AIM-V培養(yǎng)液(含GM-CSF 800 U/ml)，第4天加入IL-4 1 000 U/ml，第6天加入TNF-α(100 IU/ml)刺激成熟，第7天檢測DC表型，合格后與CIK細胞共培養(yǎng)。至14 d收集細胞獲得D-CIK細胞，檢測合格后進行細胞回輸治療。

1.3.2 循環(huán)中腫瘤細胞數(shù)目的檢測采用CellSearch系統(tǒng)專用CellSave管，分別于治療前和治療后第4周抽取患者外周血，經(jīng)過離心后，在CellTracks自動反應儀中進行系列免疫反應，接著在磁槽中進行孵化，最后由CellTracks自動分析儀掃描和分析結(jié)果。采樣后72 h內(nèi)完成實驗，每次檢測需至少含一次質(zhì)控品。

1.3.3 不良反應的處理觀察D-CIK回輸過程中患者發(fā)生的不良反應，并及時給予對癥處理措施。

1.4 統(tǒng)計學方法應用SPSSl0.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料兩組數(shù)據(jù)之間的比較采用配對t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 D-CIK治療前后患者CTCs變化情況每例乳腺癌患者在接受D-CIK治療前后，分別采用Cellsearch檢測系統(tǒng)檢測CTCs的數(shù)目。在治療前患者CTCs的數(shù)量為5～18個/7.5 ml；治療后數(shù)量減少為2～11個/7.5 ml，每例患者的具體數(shù)值變化見表2。采用配對t檢驗方法對比D-CIK治療前后CTCs的數(shù)目。結(jié)果顯示，經(jīng)過D-CIK治療后，CTCs的數(shù)量與治療前相比較明顯減少，差異具有統(tǒng)計學的意義(t= 13.998，P=0.000)。

2.2 不良反應整個治療過程中均沒有發(fā)現(xiàn)嚴重不良反應者，3例患者出現(xiàn)輕度發(fā)熱，1例患者出現(xiàn)上肢皮疹，經(jīng)對癥處理后迅速緩解。

表2 D-CIK治療前后患者CTCs變化情況

3 討論

早在19世紀中葉已經(jīng)有研究者提出循環(huán)腫瘤細胞的概念，但是由于科學技術(shù)手段的局限，對CTCs的研究一直停留在原始水平。近來隨著科技的發(fā)展，已經(jīng)發(fā)展出多種手段來檢測及鑒定CTCs，包括Cellsearch系統(tǒng)，已經(jīng)在敏感性和穩(wěn)定性方面得到了充分的驗證，并得到FDA的批準[6]。關(guān)于CTCs的臨床研究在多種腫瘤中已經(jīng)得到進行，如在關(guān)于乳腺癌的前瞻性多中心雙盲臨床試驗中，共納入177例患者。分別于治療前、治療開始后3～5周、6～8周、9～14周、15～20周數(shù)個不同階段進行CTCs水平檢測。結(jié)果顯示治療前CTCs高水平者預后較差，與低水平者比較，無進展生存時間(Progression-free survival，PFS)為2.7個月和7.0個月?？偵嫫?Overall survival，OS)為10.9個月和18.5個月。在治療過程中不同時間點的檢測結(jié)果具有同樣的趨勢。筆者認為不論在治療的任何時間點進行CTCs的檢測，對之后的病情變化均有準確的預測作用[7]。歐洲腫瘤研究院把CTC的數(shù)量作為連續(xù)變量進行研究，平均隨訪時間達到28個月。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著CTCs細胞數(shù)量的增高，PFS和OS呈現(xiàn)連續(xù)非線性的下降趨勢，這種相關(guān)性直到數(shù)量大于5個以后才逐漸減弱[8]。在結(jié)腸癌的前瞻性多中心研究中，共納入430例患者，分別在初始治療前，一線、二線、三線治療后進行CTCs的檢測。結(jié)果顯示治療前CTCs高水平者預后較差，與低水平者比較PFS為4.5個月和7.9個月，OS為9.4個月和18.5個月。即使在不良預后組，如果在治療過程中循環(huán)腫瘤細胞數(shù)量減少至3個以下，也比治療過程中細胞數(shù)量沒有明顯減少的為好，兩者比較，PFS為6.2個月和1.6個月，OS為1.0個月和3.7個月。筆者認為CTCs數(shù)量多少是PFS和OS的獨立預后因素，并且在治療過程中對治療效果有預測作用[9]。

CTCs對腫瘤進程的不利影響可能與其所具有的表皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)和腫瘤干細胞(Cancer stem cells，CSCs)的表型相關(guān)。有研究證實，在CTCs檢測陽性的乳腺癌臨床標本中，有97%表達Twist1、Akt2、PI3Kalpha三個重要EMT標志中的至少一個，而且有95%表達ALDH1這一重要的CSC標志。而在CTCs檢測陰性的標本中這些標志的表達極為低下[10]。采用Twist和Vimentin這兩個指標組合得到類似的結(jié)果，即使是在早期乳腺癌患者[11]。采用紫杉醇這些常用化療藥物處理乳腺癌細胞，除殺傷腫瘤細胞這一作用外，反而有可能促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，其作用機制包括對微管系統(tǒng)的調(diào)節(jié)[12]。由于這些特殊表型，常規(guī)的化療和靶向治療并不能產(chǎn)生針對CTCs的治療效果，甚至還可能促進CTCs的產(chǎn)生和發(fā)展。所以必須尋找可以特異性抑制CTCs的手段，才能阻斷腫瘤轉(zhuǎn)移過程，減少轉(zhuǎn)移的發(fā)生概率，最終得到生存上的獲益。

免疫治療作為腫瘤治療的重要手段之一，具有常規(guī)手術(shù)或者放化療所不具有的獨特優(yōu)勢，在腫瘤的治療實踐中得到越來越廣泛的應用。細胞因子誘導的殺傷細胞(Cytokine induced killer，CIK)技術(shù)是其中較為成熟的治療手段，而其進一步發(fā)展的D-CIK技術(shù)是指與樹突細胞(Dendritic cell，DC)共培養(yǎng)的CIK細胞。實驗證明，DC和CIK共同培養(yǎng)后兩種細胞的數(shù)量和活性都有明顯增高，同時IL-12分泌水平也有同步的增高[13]。不但對普通腫瘤細胞具有殺傷作用，并且對于那些常規(guī)化療藥物耐藥的腫瘤細胞，也具有肯定的殺傷作用[14]。多個臨床研究已經(jīng)證實，D-CIK細胞技術(shù)可以改善腫瘤患者的PFS和OS，并且不良反應輕微[15-17]。但是其具體作用機制尚不完全明確，尤其是臨床證據(jù)尚不充分。所以我們根據(jù)既往研究成果推測，D-CIK技術(shù)改善腫瘤預后的原因可能是對針對循環(huán)腫瘤細胞的特異性殺傷與抑制，從而減少腫瘤細胞進一步轉(zhuǎn)移擴散的機會，最終獲得臨床生存的收益。

本次研究中我們發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者接受D-CIK治療后，其循環(huán)血中腫瘤細胞數(shù)目與治療前相比較明顯減少，其差異具有統(tǒng)計學意義。據(jù)此我們推測，D-CIK治療可能通過抑制CTCs來減少腫瘤復發(fā)及轉(zhuǎn)移機會，但其具體機制值得進一步研究。本次研究結(jié)果對于深入理解生物免疫療法在乳腺癌治療中的作用與地位具有積極的意義。

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Inhibition of D-CIK on circulating tumor cells in advanced breast cancer.

MA Lei1,WU Si-pei2,DENG Xu-bin1, JIN Chuan1,LU Qin1,LIU Xiao-yan1,CHEN Wen-sheng1,ZOU Qing-feng1.1.The Third District of Internal Medicine Department,Affiliated Cancer Hospital of Guangzhou Medical University/Cancer Center of Guangzhou Medical University (CCGMU),Guangzhou 510095,Guangdong,CHINA;2.Institute of Lung Cancer Research,Guangdong Provincial People's Hospital,Guangzhou 510095,Guangdong,CHINA.

ObjectiveTo investigate the effect of D-CIK on circulating tumor cells(CTCs)in patients with advanced breast cancer.MethodsThirty-two cases of advanced breast cancer were included.The number of tumor cells in peripheral blood circulating was detected before and after D-CIK therapy by Cellsearch system.Related adverse reactions were also observed during the treatment.ResultsAfter treatment,the number of tumor cells in peripheral blood circulating decreased from 5～18/7.5 ml(before treatment)to 2～11/7.5 ml with a statistical difference (P＜0.05).No severe side effect was observed during treatment.ConclusionD-CIK treatment could inhibit the CTCs in breast cancer.

D-CIK;Breast cancer;Circulating tumor cells

R737.9

A

1003—6350（2014）13—1884—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.13.0732

2014-04-08)

廣東省科技廳科研項目（編號：2011B080701021）；廣州醫(yī)學院科研項目（編號：2013C61）

馬磊。E-mail：ml18882@163.com