脊髓康對大鼠脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達的影響

郭楊，馬勇,2，潘婭嵐，成吉華，黃桂成

·專題·

脊髓康對大鼠脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達的影響

郭楊1，馬勇1,2，潘婭嵐1，成吉華1，黃桂成1

目的探討脊髓康對脊髓損傷(SCI)后神經(jīng)功能恢復(fù)以及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)蛋白和mRNA表達的影響。方法144只雌性Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量180～220 g，隨機抽取24只作為假手術(shù)組，僅咬除T9～T11段椎板、棘突。其余采用改良Allen法成功建立SCI動物模型后，隨機分為5組，即模型組、醋酸潑尼松組及脊髓康高、中、低劑量組，每組24只。脊髓康高、中、低劑量組分別按生藥劑量50 g/(kg?d)、25 g/(kg?d)、12.5 g/(kg?d)灌胃；醋酸潑尼松組以醋酸潑尼松0.06 g/(kg?d)灌胃；假手術(shù)組與模型組均以同體積生理鹽水灌胃。分別于術(shù)后24 h、3 d、7 d、14 d，進行Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)評分、斜板試驗，干預(yù)后3d、7d、14d處死大鼠取脊髓樣本，采用免疫組化、Western blotting、熒光定量PCR法檢測脊髓損傷區(qū)BDNF蛋白和mRNA的表達情況。結(jié)果術(shù)后24 h假手術(shù)組大鼠BBB評分、斜板試驗角度明顯高于其他各組(P＜0.01)。術(shù)后3～14 d脊髓康中劑量組和醋酸潑尼松組BBB評分均高于模型組(P＜0.05)，且術(shù)后14 d脊髓康中劑量組BBB評分明顯高于其他各組(P＜0.01)。免疫組化和Western blotting顯示，不同時間點醋酸潑尼松組和脊髓康中劑量組BDNF蛋白表達水平均明顯高于模型組(P＜0.01)，二者具有等效性(P＞0.05)。熒光定量PCR顯示，醋酸潑尼松、脊髓康可促進SCI后脊髓損傷區(qū)BDNF mRNA的表達，早期醋酸潑尼松效果較為明顯，而干預(yù)后14 d脊髓康中劑量效果明顯優(yōu)于醋酸潑尼松。結(jié)論脊髓康可促進大鼠SCI后神經(jīng)功能的恢復(fù)，提升SCI后脊髓內(nèi)BDNF蛋白及mRNA的表達水平。

脊髓損傷；脊髓康；軸突再生；微環(huán)境；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；大鼠

[本文著錄格式]郭楊，馬勇，潘婭嵐，等.脊髓康對大鼠脊髓損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達的影響[J].中國康復(fù)理論與實踐,2014,20(8):701-708.

軸突再生微環(huán)境紊亂是脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)后神經(jīng)再生障礙的重要原因，其影響因素包括炎癥反應(yīng)、膠質(zhì)瘢痕形成、神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophic factors,NTFs)缺乏及諸多抑制性因子的存在等[1]。尋找合理的治療方案改善軸突再生微環(huán)境，已成為SCI的研究熱點。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是NTFs家族中的重要成員，可調(diào)控多種神經(jīng)元的生長發(fā)育和分化，誘導(dǎo)軸突再生，抑制神經(jīng)元凋亡[2]。

脊髓康是在中醫(yī)“腎督同治”理論指導(dǎo)下，結(jié)合多年的臨床實踐而形成的驗方，具有“祛瘀通督，溫腎利濕，調(diào)和氣血”之功效。前期研究證實，脊髓康可抑制脂質(zhì)過氧化，清除氧自由基，改善損傷局部微環(huán)境[3-5]。據(jù)此推測，脊髓康這一效應(yīng)可能與其促進BDNF等相關(guān)神經(jīng)營養(yǎng)因子表達有關(guān)。

本研究旨在觀察脊髓康對SCI大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)及BDNF表達的影響，進一步驗證其治療SCI的有效性，并探索其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

144只清潔級Sprague-Dawley大鼠，雌性，體質(zhì)量180～220 g，由浙江省實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(浙)2008-0033。按5只/籠飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，自由進食、飲水。

隨機抽取24只大鼠作為假手術(shù)組，其余120只大鼠造模成功后采用隨機數(shù)字表法隨機分為5組，即模型組，醋酸潑尼松組及脊髓康高、中、低劑量組，每組24只。各組大鼠再隨機分為3d、7d、14d三個時間點組，每組8只。

1.2 動物模型制備

采用改良Allen法建立大鼠SCI動物模型。10%水合氯醛腹腔麻醉成功后，俯臥位固定于簡易固定臺上；以T10為中心作“十”字形標(biāo)記定位；無菌條件下沿正中做2～3 cm縱形切口，暴露T9～T11棘突，切開并掀除兩側(cè)椎板，充分暴露T10及部分T9、T11段脊髓背側(cè)硬膜。

自距硬脊膜25 mm高處，將自制脊髓打擊裝置(不銹鋼實心金屬棒，直徑3mm，高18cm，重10g；帶有刻度的玻璃套管，內(nèi)徑4mm，長5cm)沿玻璃套管垂直自由落下，撞擊T10段脊髓硬脊膜，撞擊能量為25mm×10g，損傷直徑為3mm。

撞擊成功的標(biāo)志：脊髓局部腫脹明顯，但硬脊膜無破損，硬膜后正中靜脈充血增粗，大鼠出現(xiàn)尾巴痙攣性擺動，雙后肢呈弛緩性癱瘓。

假手術(shù)組僅咬除T9～T11段椎板、棘突，不損傷脊髓。

術(shù)畢椎旁肌肉注射4×105U青霉素預(yù)防感染，生理鹽水沖洗切口，逐層縫合，外敷紅霉素軟膏。

1.3 主要試劑

Envision免疫組化檢測試劑盒(福建邁新生物技術(shù)有限公司)；RIPA裂解液、PMSF、BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云生物技術(shù)有限公司)；#4970S兔抗鼠βactin單克隆抗體(CST，美國)；ab108319兔抗鼠BDNF單克隆抗體(ABCAM，美國)；BS13278羊抗兔二抗(BIOWORLD，美國)；牛血清白蛋白(ROCHE，美國)；29∶1丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺混合物(ACRBIS)、0.22μm PVDF膜(BIO-RAD，美國)；預(yù)染蛋白Marker(GENEDIREX，中國臺灣)；ECL化學(xué)發(fā)光底物(THERMO，美國)；RR036A逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒、PR820A熒光定量反應(yīng)試劑盒(TAKARA，寶生物工程有限公司)。

1.4 主要儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)；酶聯(lián)免疫檢測儀(PE-PerkinElmer，美國)；高速臺式冷凍離心機、面包式離心機(EPPENDORF，德國)；Transblot?SD蛋白半干轉(zhuǎn)印儀(BIO-RAD，美國)；Image Quant LAS4000mini化學(xué)發(fā)光成像儀(GE，美國)；蛋白核酸分析儀、PCR自動系列化分析儀(EPPENDORF，德國)；7500實時熒光定量PCR儀(APPLIED BIOSYSTEMS)。

1.5 實驗藥物制備

1.5.1 中藥脊髓康藥液中藥脊髓康復(fù)方主要由生黃芪、當(dāng)歸、川芎、丹參、地鱉蟲、赤芍、仙靈脾、制大黃等組成，分別按生藥劑量2.5 g/ml、1.25 g/ml、0.625 g/ml于南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)實驗研究中心制成水煎劑，4℃保存?zhèn)溆?，其中生藥購自南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科。

1.5.2 0.3%醋酸潑尼松片(強的松片)藥液取醋酸潑尼松片300 mg(5 mg/片，天津藥業(yè)集團新鄭股份有限公司)，研磨成粉末，溶于100 ml生理鹽水中，渦旋混勻，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 動物護理及干預(yù)

各組SCI大鼠均于術(shù)后按摩下腹部，擠壓膀胱助其排尿排便，注意預(yù)防切口感染。

各組大鼠麻醉蘇醒后30min即開始給予相應(yīng)的處理。采用“按動物體表面積比率換算等計量法”計算各處理藥物的臨床等效劑量，醋酸潑尼松組給予臨床等效劑量0.06g/(kg?d)，脊髓康中劑量組為臨床等效劑量25 g/(kg?d)，高劑量組給藥50 g/(kg?d)，低劑量組給藥12.5 g/(kg?d)。各組大鼠均按體積20 ml/(kg?d)灌胃給藥，每日劑量分兩次灌胃。假手術(shù)組和模型組均給予同等劑量的生理鹽水灌胃。各實驗組分別按時間點在最后1次灌胃后2 h處死取材。

1.7 觀察指標(biāo)

1.7.1 神經(jīng)功能評價

1.7.1.1 Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)評分BBB評分標(biāo)準(zhǔn)以原英文版為主[6]，參考傅強等[7]制定。

分別于術(shù)后24 h、3 d、7 d、14 d，由對分組情況不知情的兩人獨立觀察記錄，對各組大鼠后肢進行BBB運動功能評分。

1.7.1.2 斜板試驗將大鼠置于一個長方形木制斜板上，大鼠身體縱軸線與斜板縱軸垂直位放置，逐漸升高斜板高度，以大鼠能夠在斜板上停留5 s的最大角度為功能值，每只大鼠測3次，取其平均值為最終測定角度。

分別于術(shù)后24 h、3 d、7 d、14 d，對各組大鼠進行斜板試驗。

1.7.2 標(biāo)本制備分別于干預(yù)后3 d、7 d、14 d，每組隨機抽取3只大鼠，采取心臟灌注固定法進行取材。迅速沿原切口暴露脊髓，于損傷脊髓中心頭、尾側(cè)各1 cm處切斷脊髓，置于4%多聚甲醛中固定24 h，經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明后，行石蠟包埋，在距離脊髓直接損傷處5 mm部位連續(xù)進行厚約4～5μm的超薄切片，每個樣本10張，待免疫組化用。

干預(yù)后3 d、7 d、14 d，每組剩余大鼠同上取出脊髓標(biāo)本，放入冰冷生理鹽水中沖洗干凈，液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-70℃冰箱保存，用于Western blotting和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)。

1.7.3 免疫組織化學(xué)法取上述石蠟切片，按Envision法進行免疫組織化學(xué)染色，主要步驟如下。

常規(guī)脫蠟至水，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，3% H2O2室溫封閉，滴加抗原修復(fù)液修復(fù)，滴加一抗(1∶250)室溫孵育60min，每張切片加聚合物增強劑(試劑A)50 μl，室溫孵育20min，再加酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物(試劑B)50 μl，室溫孵育30min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，0.1%鹽酸分化，用梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片。在200倍光鏡下觀察拍片，以淡黃色或棕黃色顆粒染色為陽性表達。每張切片隨機選取5個視野，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，以平均光密度值(optical density,OD)表示各組BDNF蛋白的相對表達量。

1.7.4 Western blotting法取出脊髓組織，按20 mg組織加入RIAP裂解液150～250 μl與PMSF混合液，球磨儀研磨組織，冰上裂解30min，4℃15000 r/min離心30min，取上清，BCA法蛋白定量并調(diào)整使各組總蛋白含量一致，2×上樣緩沖液混勻蛋白變性，冷卻后放入-70℃冰箱備用。5%濃縮膠及10%分離膠SDSPAGE凝膠電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)印，5%TBST脫脂奶粉室溫封閉2 h，BDNF一抗(1∶1000)4℃孵育過夜，羊抗兔二抗(1∶5000)室溫孵育2 h，ECL法顯色，Image Quant LAS 4000mini超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀成像。Adobe Photoshop CS5軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白/β-actin條帶灰度值比值表示BDNF蛋白相對表達水平。

1.7.5 熒光定量PCR法Genbank上查找大鼠BDNF和內(nèi)參GAPDH的編碼序列，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物后經(jīng)BLAST驗證，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，具體序列見表1。

表1 PCR引物序列

Trizol法提取組織總RNA，測定波長260nm與280nm處的吸光度OD值，確定總RNA的純度和濃度。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37℃15min逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，85℃15 s、35℃30 s滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。參照TakaRa熒光定量試劑盒，按照ABI 7500熒光定量PCR儀操作說明，設(shè)定兩步法熒光定量PCR擴增程序，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火34 s，上述變性、退火步驟循環(huán)40次。隨后進行建立熔解曲線反應(yīng)：95℃15 s，60℃1min，95℃15 s。采用2-△△Ct法分析BDNF基因在脊髓組織中的相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

所得數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包進行分析，正態(tài)分布定量資料以(±s)表示，采用單因素方差分析和LSD法比較；偏態(tài)分布定量資料以中位數(shù)M和四分位數(shù)(Q1,Q3)描述，采用Mann-WhitneyU或Kruskal-WallisH非參數(shù)檢驗。顯著性水平α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 BBB評分

經(jīng)Kruskal-WallisH統(tǒng)計分析，術(shù)后24 h假手術(shù)組BBB評分顯著高于其他各組(χ2=28.073,P＜0.001)，經(jīng)Mann-WhitneyU檢驗，其他各損傷組間BBB評分無顯著性差異(P＞0.05)。

術(shù)后3 d各損傷組大鼠后肢仍拖行，醋酸潑尼松組、脊髓康高、中劑量組BBB評分均高于模型組(P＜0.01,P=0.017,P＜0.01)，而前三組間比較無顯著性差異(P＞0.05)。術(shù)后7 d各治療組大鼠的后肢活動均有明顯改善，較模型組均明顯有力(P＜0.01)；而脊髓康中劑量組與醋酸潑尼松組相比無顯著性差異(P=0.479)。術(shù)后14 d，醋酸潑尼松組、各脊髓康治療組BBB評分均高于模型組(P＜0.05)，且脊髓康中劑量組明顯高于醋酸潑尼松組(P＜0.01)。見表2。

2.2 斜板試驗

術(shù)前各組大鼠斜板試驗角度比較，F(xiàn)=1.536，P= 0.215。術(shù)后24 h，各組大鼠斜板試驗角度較假手術(shù)組均明顯降低(P＜0.01)。LSD比較顯示，醋酸潑尼松組、脊髓康各劑量組與模型組均無顯著性差異(P＞0.05)。術(shù)后3 d，醋酸潑尼松組、脊髓康中劑量組大鼠斜板試驗角度高于模型組(P=0.002,P=0.016)，而兩組間相比無顯著性差異(P=0.474)。術(shù)后7 d和14 d，醋酸潑尼松組、脊髓康中劑量、低劑量組大鼠斜板試驗角度均明顯高于模型組(P＜0.01)，且脊髓康中劑量組明顯優(yōu)于醋酸潑尼松組(P=0.006,P=0.002)。見表3。

2.3 BDNF蛋白免疫組化

假手術(shù)組脊髓損傷區(qū)各時間點BDNF均有少量表達。SCI后BDNF表達迅速增強，術(shù)后各時間點模型組及各治療組陽性細(xì)胞數(shù)較假手術(shù)組增多。模型組術(shù)后BDNF表達水平早期逐漸升高，14 d后略有下降趨勢，與假手術(shù)組相比無顯著性差異(P=0.119)，而醋酸潑尼松組、脊髓康中劑量組術(shù)后3 d、7 d變化趨勢逐漸增強，14 d時仍顯著高于假手術(shù)組，且與模型組相比有顯著性差異(P＜0.05)。醋酸潑尼松組、脊髓康組中劑量組相比無顯著性差異(P=0.983,P=0.177,P= 0.291)，但14 d后可看出脊髓康中劑量組升高趨勢較醋酸潑尼松組明顯。見表4、圖1～圖3。

2.4 BDNF蛋白Western blotting

模型組及各治療組術(shù)后BDNF蛋白變化趨勢基本同免疫組化結(jié)果，術(shù)后3 d假手術(shù)組BDNF蛋白條帶灰度值均低于其他各組，但僅脊髓康中劑量組與假手術(shù)相比有顯著性差異(P=0.032)。術(shù)后7 d除脊髓康高劑量組外，各組BDNF條帶灰度值仍高于假手術(shù)組，醋酸潑尼松組、脊髓康中劑量組與模型組相比有非常高度顯著性差異(P＜0.001)。術(shù)后14 d，模型組BDNF條帶灰度值變化不大，而醋酸潑尼松組、脊髓康中劑量、低劑量組仍維持在較高水平，且醋酸潑尼松組、脊髓康中劑量組與模型組相比有非常高度顯著性差異(P＜0.001)。見表5和圖4。

2.5 BDNF mRNA表達

術(shù)后3 d，醋酸潑尼松組BDNF mRNA表達水平明顯高于模型組(P=0.001)，脊髓康中劑量組BDNF mRNA的相對表達量也高于模型組，但無顯著性差異(P=0.066)；術(shù)后7 d，醋酸潑尼松組、脊髓康中劑量組的BDNF mRNA表達水平均高于模型組(P=0.026,P=0.048)，而兩組間比較無顯著性差異(P=0.733)；術(shù)后14 d，醋酸潑尼松組、脊髓康中劑量組的BDNFmRNA表達水仍高于模型組，其中脊髓康中劑量組明顯高于模型組(P＜0.01)，且明顯高于醋酸潑尼松組(P= 0.003)。見表6。

表2 各組大鼠不同時間點BBB評分結(jié)果

表3 各組大鼠不同時間點斜板試驗結(jié)果(°)

表4 各組大鼠SCI后脊髓損傷區(qū)BDNF免疫組化陽性表達水平(OD)

表5 各組大鼠SCI后脊髓損傷區(qū)BDNF蛋白相對表達水平(灰度比)

表6 各組大鼠SCI后脊髓損傷區(qū)BDNF mRNA相對表達量

圖1 各組大鼠SCI后3 d脊髓損傷區(qū)BDNF蛋白表達(免疫組化染色，200×)

圖2 各組大鼠SCI后7 d脊髓損傷區(qū)BDNF蛋白表達(免疫組化染色，200×)

圖3 各組大鼠SCI后14 d脊髓損傷區(qū)BDNF蛋白表達(免疫組化染色，200×)

圖4 各組大鼠SCI后脊髓損傷區(qū)BDNF蛋白表達顯影

3 討論

一般認(rèn)為，SCI后引起的功能下降主要由原發(fā)性和繼發(fā)性損傷共同造成，并可能以后者作用更為嚴(yán)重[8]。繼發(fā)性損傷包括各種致炎細(xì)胞因子引發(fā)的炎癥反應(yīng)以及SCI后各種因素促發(fā)膠質(zhì)細(xì)胞的活化和瘢痕組織的形成等，都直接或間接地影響神經(jīng)再生微環(huán)境。由此可見，如何有效改善SCI后的微環(huán)境已成為促進軸突再生的一個關(guān)鍵問題。

NTFs是軸突再生微環(huán)境中的一組重要因子，除對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有營養(yǎng)作用外，還可能參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的修復(fù)，如生長相關(guān)蛋白-43(growth associated protein-43,GAP-43)、神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)、BDNF、神經(jīng)營養(yǎng)素等[9-11]，其中BDNF是目前研究最為廣泛和深入的NTFs之一。研究表明，BDNF可誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells, NSCs)增殖、分化，調(diào)節(jié)自由基代謝，減少自由基積聚，保護神經(jīng)元免受自由基的攻擊[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)，SCI后損傷脊髓局部BDNF免疫反應(yīng)陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著增加，SCI后1 d和1周，大多數(shù)少突膠質(zhì)細(xì)胞呈BDNF免疫反應(yīng)陽性，提示BDNF與SCI后脊髓修復(fù)關(guān)系密切[14]。

現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)者將SCI病機歸納為：瘀血阻滯督脈，樞機統(tǒng)率失職，導(dǎo)致督脈和其他經(jīng)絡(luò)、臟腑、氣血之間的功能紊亂[15]。究其根本，與督脈的物質(zhì)基礎(chǔ)，即腎精密切相關(guān)。我們結(jié)合多年的臨床實踐，將SCI的病因病機歸納為腎督虛損，瘀阻督脈，樞機統(tǒng)率失職，并充分重視督脈、腎精在脊髓損傷及修復(fù)中的積極意義，構(gòu)建“腎督同治”理論以指導(dǎo)中醫(yī)藥促進神經(jīng)功能重塑，并篩選出具有“祛瘀通督，溫腎利濕，調(diào)和氣血”之功的中藥復(fù)方脊髓康。方中黃芪為君藥，補脾胃之元氣，以資氣血生化之源；當(dāng)歸為臣藥，養(yǎng)血和營；川芎為臣藥，行氣活血止痛；丹參、赤芍活血化瘀通絡(luò)，清熱涼血；水蛭、蜈蚣、地鱉蟲破瘀散結(jié)，通絡(luò)止痛；仙靈脾、肉蓯蓉、益智仁補益腎陽，培本固元；大黃、厚樸、枳實瀉熱通便，行氣散瘀；茯苓、澤蘭、澤瀉、車前子利水滲濕，清熱通淋，全方共奏活血化瘀，瀉下清熱，通利督脈，溫腎利濕之功。前期研究已證實，脊髓康能夠抑制一氧化氮合成酶表達，降低一氧化氮、丙二醛、腫瘤壞死因子α含量，提高超氧化物歧化酶、白細(xì)胞介素-10活性，清除氧自由基，改善軸突再生微環(huán)境，防止脊髓繼發(fā)性損傷[3-5]。

本研究結(jié)果顯示，術(shù)后24 h各組大鼠BBB評分、斜板試驗角度明顯低于假手術(shù)組(P＜0.01)。術(shù)后3～14 d，脊髓康中劑量組與醋酸潑尼松組BBB評分均高于模型組(P＜0.05)。術(shù)后14 d，脊髓康中劑量組BBB評分明顯高于其他各組，且明顯優(yōu)于醋酸潑尼松組(P＜0.01)。綜合BBB評分和斜板試驗結(jié)果，可以看出醋酸潑尼松、脊髓康均可促進SCI大鼠術(shù)后后肢運動功能的恢復(fù)。

正常成年大鼠脊髓組織內(nèi)BDNF蛋白表達較弱。本研究顯示，SCI后脊髓損傷區(qū)BDNF都有不同程度的升高，說明SCI后機體可自我保護性促進BDNF的分泌，但維持時間均較短。這與相關(guān)的文獻報道相一致。本實驗結(jié)果提示，術(shù)后不同時間點醋酸潑尼松組及脊髓康組BDNF蛋白及其mRNA表達水平較模型組均有顯著升高，術(shù)后7～14 d仍維持在較高水平。這也提示SCI后神經(jīng)元的生理活動需要更多的BDNF來維持。同時也表明，SCI后BDNF分泌增加較為緩和，能在較長時間內(nèi)維持高水平表達，提示其主要在脊髓損傷的中晚期發(fā)揮作用。結(jié)果顯示脊髓康可有效促進SCI大鼠BDNF的表達，而早期上調(diào)BDNF的作用緩慢，長期服用，藥效作用持久，與醋酸潑尼松相比具有優(yōu)勢。這與脊髓康對大鼠SCI后運動功能恢復(fù)的影響趨勢基本一致，提示脊髓康可能是通過增強BDNF的表達，改善損傷脊髓再生的微環(huán)境，從而促進損傷后運動功能的恢復(fù)。

盡管本實驗取得一定進展，但是由于觀察周期較短，難以評價中藥脊髓康促進SCI后神經(jīng)功能恢復(fù)的遠(yuǎn)期療效。同時未能與目前療效確切并應(yīng)用于臨床的甲基潑尼松龍(甲基強的松龍)對比，對脊髓康促進SCI后BDNF的表達而改善軸突再生微環(huán)境的具體分子途徑及機制尚不清楚。這也是我們下一步的研究方向。

[1]Yuan Y,Su Z,Pu Y,et al.Ethyl pyruvate promotes spinal cord repair through ameliorating the glial microenvironment[J].Br J Pharmacol,2011,164(6):1573-1576.

[2]Lin J,Wang C,Wu Z.Preliminary study on effects of human brain-derived neurotrophic factor gene-modified bone marrow mesenchymal stem cells by intravenous transplantation on structure and function of rat injured spinal cord[J].Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi,2010,24(8):982-987.

[3]Jian WW,Mao W,Gui CH.Effect of Jisuikang on kinetic dysfunction in patients after spinal injury[J].Chin J Integr Med, 2008,14(3):190-193.

[4]周建中,馬勇,殷韶健,等.中藥脊髓康治療大鼠脊髓損傷的實驗研究[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2009,21(2):71-74.

[5]Ma Y,Zhou JZ,Yang WG,et al.Effect of Jisuikang on hemorheology and inflammatory factors in rats following spinal cord injury[J].Neural Regeneration Res,2008,3(11): 1176-1180.

[6]Basso DM,Beattie MS,Bresnahan JC.A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats[J].J Neurotrauma,1995,12(1):1-21.

[7]傅強,侯鐵勝,魯凱伍,等.大鼠胸段脊髓損傷后后肢運動功能不同評價標(biāo)準(zhǔn)的比較研究[J].中國脊柱脊髓雜志,2001,11 (5):278-281.

[8]Rossignol S,Frigon A.Recovery of locomotion after spinal cord injury:some facts and mechanisms[J].Annu Rev Neurosci,2011,34:413-440.

[9]Weishaupt N,Blesch A,Fouad K.BDNF:the career of a multifaceted neurotrophin in spinal cord injury[J].Exp Neurol, 2012,238(2):254-264.

[10]Elkelini MS,Bagli DJ,Fehlings M,et al.Effects of intravesical onabotulinumtoxinA on bladder dysfunction and autonomic dysreflexia after spinal cord injury:role of nerve growth factor[J].BJU Int,2012,109(3):402-407.

[11]Novotna I,Slovinska L,Vanicky I,et al.IT delivery of ChABC modulates NG2 and promotes GAP-43 axonal regrowth after spinal cord injury[J].Cell Mol Neurobiol,2011, 31(8):1129-1139.

[12]張任飛,肖詩柔.神經(jīng)營養(yǎng)素家族類細(xì)胞因子對神經(jīng)干細(xì)胞分化影響的研究現(xiàn)狀[J].中國科技信息,2011,(2):176-178.

[13]林雙竹,楊璐璐,陳穩(wěn)根,等.神經(jīng)干細(xì)胞與腦源性神經(jīng)生長因子[J].中國醫(yī)藥指南,2011,11(15):78-80.

[14]Dougherty KD,Dreyfus CF,Black IB.Brain-derived neurotrophic factor in astrocytes,oligodendrocytes,and microglia/ macrophages after spinal cord injury[J].Neurobiol Dis,2000,7 (6 Pt B):574-585.

[15]李盛華,柴喜平,王想福,等.中醫(yī)藥治療脊髓損傷的研究進展[J].中國中醫(yī)骨傷科雜志,2010,18(11):70-72.

Effect of Jisuikang on Neural Functional Recovery and Expression of Brain-derived Neurotrophic Factor after Spinal Cord Injury in Rats

GUO Yang,MA Yong,PAN Ya-lan,CHENG Ji-hua,HUANG Gui-cheng.Institute of Traumatology&Orthopedics,Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing,Jiangsu 210023,China

ObjectiveTo explore the effect of Jisuikang on neural functional recovery,and expression of brain-derived neurotrophic factor(BDNF)protein and mRNA level after spinal cord injury(SCI).Methods144 female Sprague-Dawley rats,weighted 180 to 220 g,were used for experiment.24 rats were randomly extracted into sham group(Group A),which had their vertebral plates and spines bitten away only.The others were randomly divided into model group(Group B),prednison group(Group C),and high,middle and low doses of Jisuikang group(Groups D to F)after SCI,24 rats in each group.Group C was given 0.06 g/(kg?d)prednison,and Groups D to F were given 50,25 and 12.5 g/(kg?d)Jisuikang respectively,which were given 20 ml/(kg?d)volume by intragastric administration.Groups A and B were given the same volume of normal saline(NS).The Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)scores and oblique board test were applied to test the postoperative results 24 hours,3,7 and 14 days after SCI.The rats were executed and the spinal cord tissues were extracted 3,7 and 14 days after SCI.Immunohistochemistry,Western blotting and RQ-PCR were applied to test the expression of protein and mRNA of BDNF.ResultsBBB scores and angle of oblique board test were significantly lower in Groups B to F than in Group A 24 hours after SCI(P＜0.01).BBB scores were higher in both Groups C and E than in Group B 3 to 14 days after SCI(P＜0.05),and was significantly higher in Group E than in the other groups 14 days after SCI(P＜0.01).The results of immunohistochemistry and Western blotting showed that the protein expression of BDNF were significantly higher in Groups C and E than in Group B at different time points in the injured area after SCI(P＜0.01),while there was no significant difference between Groups C and E(P＞0.05).The results of RQ-PCR showed that prednisone and Jisuikang promoted the expression of BDNF mRNA.Group C(prednisone)had a most obvious effect at the beginning while Group E was better than Group C 14 days after SCI.ConclusionJisuikang can promote the neural functional recovery and the expression of BDNF on both protein andmRNAlevel in SCI rats.

spinal cord injury;Jisuikang;axonal regeneration;microenvironment;brain-derived neurotrophic factor;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2014.08.001

R651.2

A

1006-9771(2014)08-0701-08

2014-03-26

2014-04-28)

1.江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計劃項目(No.CXZZ12_0609)；2.江蘇省自然科學(xué)基金資助項目(No.BK2011180)。

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)骨傷研究所，江蘇南京市210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨傷科，江蘇南京市210029。作者簡介：郭楊(1985-)，男，江蘇宿遷市人，博士研究生，主要研究方向：中醫(yī)藥防治骨關(guān)節(jié)病。通訊作者：黃桂成(1958-)，男，江蘇儀征市人，教授，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：中醫(yī)藥治療頸肩腰腿痛。E-mail:286745885@qq.com。

時間：2014-06-13 10:04

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3759.R.20140613.1004.001.html