沈陽漢族人群細(xì)胞色素P450酶1A2基因多態(tài)性與慢性阻塞性肺疾病易感性的關(guān)聯(lián)

趙龍，李瑩，陳達(dá)，馬濤，許林暉，夏書月

沈陽漢族人群細(xì)胞色素P450酶1A2基因多態(tài)性與慢性阻塞性肺疾病易感性的關(guān)聯(lián)

趙龍1，李瑩2，陳達(dá)3，馬濤4，許林暉1，夏書月1

目的探討沈陽市漢族人群細(xì)胞色素P450酶1A2(CYP1A2)基因多態(tài)性與慢性阻塞性肺疾病(COPD)遺傳易感性的關(guān)系。方法采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RELP)方法檢測(cè)100例COPD患者和年齡、性別匹配的100名健康人CYP1A2基因不同位點(diǎn)多態(tài)性等位基因及基因型頻率分布。結(jié)果兩組不同位點(diǎn)多態(tài)性基因型頻率分布均符合遺傳性Hardy-Weinberg平衡(均P＞0.05)。COPD患者和健康人的1D和1F基因型和等位基因頻率分布有顯著性差異(P＜0.05)，1C和1E基因型和等位基因頻率分布無顯著性差異(P＞0.05)。結(jié)論CYP1A2基因1D和1F多態(tài)性可能與COPD遺傳易感性增加有關(guān)。

慢性阻塞性肺疾病；細(xì)胞色素P450酶1A2；基因多態(tài)性；易感性

[本文著錄格式]趙龍，李瑩，陳達(dá)，等.沈陽漢族人群細(xì)胞色素P450酶1A2基因多態(tài)性與慢性阻塞性肺疾病易感性的關(guān)聯(lián)[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2014,20(9):873-876.

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種以不完全可逆性氣流受限為特征的呼吸系統(tǒng)疾病[1]。全球范圍內(nèi)每年約有270萬人死于COPD，位居所有死亡原因的第4位，超過6億人口受到該疾病的折磨[2]。COPD的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，遺傳和環(huán)境因素的相互作用在COPD的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[3]。細(xì)胞色素P450氧化酶(cytochrome-P450,CYP450)是人體內(nèi)重要的代謝酶，廣泛存在于生物體內(nèi)，參與代謝多種藥物、前致癌物、前毒物和致變劑，并可調(diào)節(jié)機(jī)體與環(huán)境的相互作用，以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[4-5]。CYP1A2是CYP450超家族中的重要成員之一，它主要存在于肝臟，許多致癌劑，如黃曲酶毒素、芳香化合物、氨基化合物等均經(jīng)CYP1A2代謝[6]。CYP1A2活性受遺傳、藥物、吸煙、飲食等因素的影響，其中遺傳因素是導(dǎo)致CYP1A2活性產(chǎn)生個(gè)體差異的基礎(chǔ)[7]。多項(xiàng)研究顯示，基因突變可導(dǎo)致肝臟內(nèi)CYP1A2合成減少，從而降低CYP1A2的活性，并可能影響個(gè)體對(duì)COPD易感性的差異[8-10]。本研究探討CYP1A2基因不同位點(diǎn)多態(tài)性與COPD遺傳易感性的關(guān)聯(lián)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 COPD組選擇2009年1月～2013年1月在沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院住院治療的COPD患者100例，其中男性57例，女性43例；平均年齡(54.3±7.3)歲。所有患者均經(jīng)X線胸片或胸部CT及肺功能檢查證實(shí)為COPD，符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)COPD學(xué)組制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)(2007年修訂版)[11]。其中，重度COPD患者27例，中度51例，輕度22例。

1.1.2 對(duì)照組選擇在本院門診部體檢的正常健康人群100人，其中男性53人，女性47人；平均年齡(49.3± 6.8)歲。均無呼吸系統(tǒng)慢性疾病病史，且經(jīng)X線胸片、肺功能等檢查除外肺部其他疾病。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本采集所有受試對(duì)象均空腹采集外周靜脈血5 ml，放入EDTA抗凝管中，-80℃保存。

1.2.2 DNA提取嚴(yán)格按照DNA提取試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)說明書，依次按細(xì)胞沉淀、蛋白沉淀、DNA沉淀和DNA純化步驟提取基因組DNA。在血樣加入PBS 2 ml混勻，3000 r/min離心15 min，棄上清。沉淀加入300 μl細(xì)胞裂解液，37℃水浴60 min，再加入20%十二烷基硫酸鈉50 μl和蛋白酶K 20 mg/ml水浴過夜。取經(jīng)消化的細(xì)胞液300 μl，按31∶1加入酚-氯仿-異戊醇(251∶241∶1)，混勻10 min，3000 r/min離心10 min；將上層水相移入另一EP管中重復(fù)抽提1次，取上層水相再用200 μl氯仿抽提1次，離心后，取上層水相加入2倍體積冷凍無水乙醇及1/30體積2 mmol/L醋酸鈉，析出DNA。12000 r/min離心10 min，棄上清，以70%乙醇洗滌2次，加入30～50 μl三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸充分溶解DNA，采用分光光度法測(cè)定DNA濃度，分裝，-20℃保存。

1.2.3 多態(tài)性檢測(cè)采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)檢測(cè)CYP1A2基因4個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性(CYP1A2*1C/1D/1E/1F)。PCR擴(kuò)增試劑盒及ApaⅠ限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司，引物序列見表1[10]。

PCR的反應(yīng)體系為25 μl，其中含有50 ng基因組DNA、200 μmol/L dNTPs、0.2 μmol/L引物、1×PCR緩沖液和1 U TaqDNA聚合酶，引物和試劑均購自大連寶生物公司。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性30 s，60℃退火20 s，延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，最后延伸5 min。RFLP的反應(yīng)體系為15 μl，包括PCR產(chǎn)物8 μl，1×酶切緩沖液和8 U限制性內(nèi)切酶ApaⅠ，20℃溫育4 h。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析。兩組基線特征比較采用t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)，組間等位基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Hardy-Weinberg平衡(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE)檢驗(yàn)各組基因多態(tài)性頻率分布是否具有群體代表性[12]。所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)，顯著性水平α=0.05。

表1 引物設(shè)計(jì)、片段長(zhǎng)度及內(nèi)切酶

2 結(jié)果

2.1 基線特征

COPD組和健康對(duì)照組在年齡、性別、血紅蛋白含量、紅細(xì)胞比容、吸煙史等方面均無顯著性差異(P＞0.05)。COPD組與健康對(duì)照組的C反應(yīng)蛋白、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、乳酸脫氫酶、第l秒用力呼氣量(forced expiratory volume in one second,FEV1)、用力肺活量(forced vital capacity,FVC)和FEV1/FVC方面有顯著性差異(P＜0.05)。見表2。

2.2 1C

兩組各基因型頻率分布均符合HWE平衡(P= 0.717,P=0.677)。兩組G/G、G/A和A/A基因型頻率和等位基因頻率分布均無顯著性差異(P＞0.05)。見表3。

2.3 1D

兩組各基因型頻率分布均符合HWE平衡(P= 0.295,P=0.385)。兩組T/T、T/Del和Del/Del基因型頻率和等位基因頻率分布均有非常顯著性差異(P＜0.01)。見表4。

表2 兩組基線特征比較

表3 兩組CYP1A2＊1C多態(tài)性分布比較(n)

表4 兩組CYP1A2＊1D多態(tài)性分布比較(n)

2.4 1E

兩組各基因型頻率分布均符合HWE平衡(P= 0.677,P=0.920)。兩組T/T、T/G和G/G基因型頻率和等位基因頻率分布均無顯著性差異(P＞0.05)。見表5。

表5 兩組CYP1A2＊1E多態(tài)性分布比較(n)

2.5 1F

兩組各基因型頻率分布均符合HWE平衡(P= 0.106,P=0.883)。兩組C/C、C/A和A/A基因型頻率和等位基因頻率分布均有顯著性差異(P＜0.05)。見表6。

表6 兩組CYP1A2＊1F多態(tài)性分布比較(n)

3 討論

近年來，由于環(huán)境惡化、大氣污染、人口老化等多方面原因，COPD在全球發(fā)病呈明顯上升趨勢(shì)[13]。COPD已成為歐美發(fā)達(dá)國(guó)家最常見的呼吸系統(tǒng)疾病，也是我國(guó)最常見的嚴(yán)重危害人民身體健康的慢性呼吸系統(tǒng)疾病[14]。

COPD的具體發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。流行病學(xué)研究表明，COPD患者具有家族聚集傾向，且不同國(guó)度、不同民族COPD發(fā)病率不同，提示COPD的復(fù)雜發(fā)病過程不僅僅與環(huán)境因素有關(guān)，還可能與遺傳易感密切相關(guān)[15-17]。吸煙是COPD最主要的致病因素，但并非所有吸煙人群最終都會(huì)患COPD，這可能與個(gè)體易感性差異有關(guān)[18-19]。煙草中的主要有害物質(zhì)是尼古丁和煙草特有亞硝胺，它們?cè)谌梭w內(nèi)的代謝主要由CYP450代謝酶調(diào)控[20]。CYP1A2作為CYP450超家族中重要成員之一，可參與多環(huán)芳烴代謝，能被多環(huán)芳烴強(qiáng)烈誘導(dǎo)；其誘導(dǎo)是由誘導(dǎo)劑與細(xì)胞內(nèi)相對(duì)特異的芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor,AHR)結(jié)合而引發(fā)的。AHR與誘導(dǎo)劑結(jié)合形成復(fù)合物，進(jìn)入細(xì)胞核與AHR核運(yùn)轉(zhuǎn)因子結(jié)合成異二聚體，異二聚體通過與CYP1A2啟動(dòng)子區(qū)上游的特異性結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，調(diào)節(jié)CYP1A2的轉(zhuǎn)錄，從而改變CYP1A2的活性[21-23]。藥物代謝酶遺傳多態(tài)性是引起臨床藥代動(dòng)力學(xué)改變、毒副作用和治療失敗的主要因素[24]。CYP1A2酶也存在基因多態(tài)性，主要表現(xiàn)為編碼區(qū)核苷酸序列改變而引起氨基酸替換，從而改變酶的活性或與底物結(jié)合能力的改變[7]。

近年來，國(guó)內(nèi)外許多研究探討了CYP1A2基因多態(tài)與吸煙相關(guān)性疾病的關(guān)系，其中CYP1A2基因多態(tài)性與COPD易感性是近年來的研究重點(diǎn)[25-27]。CYP1A2基因位于第15號(hào)染色體上，全長(zhǎng)約7.8 kb，包括7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子，其中55 bp的第1外顯子為非編碼外顯子[28]。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)CYP1A2至少14種單核苷酸多態(tài)，其中研究較多是CYP1A2*1C、CYP1A2*1D、CYP1A2*1E和CYP1A2*1F。但眾多研究結(jié)果并未就CYP1A2基因多態(tài)性與COPD相關(guān)性達(dá)成一致。Uslu等研究結(jié)果表明，CYP1A2*1F與CYP1A2*1D等位基因在COPD組顯著高于健康對(duì)照組，提示CYP1A2*1F與CYP1A2*1D基因多態(tài)COPD易感性有關(guān)[10]；但Cheng等研究卻發(fā)現(xiàn)CYP1A2*1F與COPD發(fā)病無關(guān)[8]。

本研究對(duì)COPD患者和健康對(duì)照人群CYP1A2基因4種常見多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CYP1A2*1D和CYP1A2*1F多態(tài)性與COPD易感性增加有關(guān)，CYP1A2*1D的T等位基因和CYP1A2*1F的C等位基因可能是COPD的危險(xiǎn)因素。

大多數(shù)藥物或毒物代謝均需通過肝微粒體的CYP1A2酶，基因變異可能導(dǎo)致個(gè)體酶活性的差異，進(jìn)而由其催化的許多代謝和效應(yīng)就存在著明顯差異[4]。多項(xiàng)研究證實(shí)，CYP1A2*1D和CYP1A2*1F多態(tài)性對(duì)代謝酶的活性和誘導(dǎo)能力影響最明顯，故這兩個(gè)多態(tài)性可能是CYP1A2基因參與COPD發(fā)生和發(fā)展重要的因素[6,10,23]。

本研究顯示，CYP1A2*1C和CYP1A2*1E多態(tài)性與COPD易感性無統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)，提示這兩個(gè)多態(tài)性可能通過與CYP1A2*1D和CYP1A2*1F多態(tài)性聯(lián)合作用促進(jìn)COPD的發(fā)生。

本研究仍存在一定局限性。首先，盡管兩組研究對(duì)象年齡、性別、吸煙史等基線特征相似，但由于樣本量有限，研究結(jié)果仍可能存在一定的偏移。其次，雖然兩組研究對(duì)象各多態(tài)性基因型頻率符合HWE平衡，但各組基因型頻率也可能受到環(huán)境因素、身體因素、家族遺傳因素等的影響產(chǎn)生差異。再次，由于研究對(duì)象臨床隨訪資料有限，本研究未能將環(huán)境因素如工作性質(zhì)、家族史、居住環(huán)境等因素和基因多態(tài)性的關(guān)系進(jìn)行關(guān)聯(lián)研究，使本研究結(jié)果臨床應(yīng)用價(jià)值受到局限。因此，進(jìn)一步擴(kuò)大研究對(duì)象樣本量，探討環(huán)境因素和基因因素在COPD發(fā)生和發(fā)展過程中的聯(lián)合作用，對(duì)指導(dǎo)臨床預(yù)防、診斷和治療COPD仍有重要的價(jià)值。

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Relationship between Cytochrome P450 1A2 Gene Polymorphism and Susceptibility to Chronic Obstructive Pulmonary Disease

ZHAO Long,LI Ying,CHEN Da,MA Tao,XU Lin-hui,XIA Shu-yue.Department of Respiratory Medicine,Central Hospital of Shenyang Medical College,Shenyang,Liaoning 100024,China

ObjectiveTo investigate the relationship between cytochrome P450 1A2(CYP1A2)gene polymorphism and susceptibility to chronic obstructive pulmonary disease(COPD).MethodsCYP1A2 gene polymorphisms in 100 COPD cases and 100 healthy controls were tested with polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RELP).ResultsGenotype frequencies of 4 SNPs in both the COPD and control groups were in accordance with Hardy-Weinberg equilibrium(P＞0.05).There was significant difference between the COPD and control groups in genotype and allele frequencies of 1D and 1F(P＜0.05),but not of 1C and 1E(P＞0.05).Conclusion CYP1A2*1D and CYP1A2*1F polymorphisms may play an important role in the development of COPD.

chronic obstructive pulmonary disease;cytochrome P450 1A2;gene polymorphism;susceptibility

10.3969/j.issn.1006-9771.2014.09.021

R562.2

A

1006-9771(2014)09-0873-04

2013-10-29

2013-12-06)

1.沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院呼吸科，遼寧沈陽市110024；2.沈陽市紅十字會(huì)醫(yī)院呼吸內(nèi)科，遼寧沈陽市110013；3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院急診科，遼寧沈陽市110032；4.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科，遼寧沈陽市110001。作者簡(jiǎn)介：趙龍(1976-)，男，滿族，遼寧本溪市人，碩士，主治醫(yī)師，主要研究方向：呼吸系統(tǒng)疾病的基礎(chǔ)與臨床。