大鼠脂肪干細(xì)胞分離培養(yǎng)及細(xì)胞表型的研究

呂春燕，陳高莉，楊 玲，陳昌金，袁 慧，楊雪梅

(1.成都市第五人民醫(yī)院病理科，四川 成都 611130；

2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 成都 610072；3.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610072)

大鼠脂肪干細(xì)胞分離培養(yǎng)及細(xì)胞表型的研究

呂春燕1，陳高莉2，楊 玲2，陳昌金3，袁 慧3，楊雪梅3

(1.成都市第五人民醫(yī)院病理科，四川 成都 611130；

2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 成都 610072；3.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610072)

目的分離、培養(yǎng)和凍存大鼠脂肪干細(xì)胞，并對(duì)其相關(guān)的細(xì)胞表型進(jìn)行研究，為利用脂肪干細(xì)胞治療梗阻性腎病腎纖維化等實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。方法取大鼠3只，經(jīng)消毒麻醉，采集其腹股溝處脂肪組織分離培養(yǎng)其中的脂肪干細(xì)胞，用相差倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長方式及形態(tài)變化。取第三代細(xì)胞用流式細(xì)胞儀作細(xì)胞免疫表型的鑒定。凍存復(fù)蘇后再次檢測(cè)干細(xì)胞生長情況及表型。結(jié)果大鼠脂肪組織中含有大量間充質(zhì)干細(xì)胞，原代培養(yǎng)的ASCs呈小圓形或星形，經(jīng)傳代后的脂肪干細(xì)胞形態(tài)比較均一，呈長梭形，個(gè)別略呈多角形、漩渦樣生長。其細(xì)胞表型為CD29、CD44高表達(dá)，CD73、CD105中等程度表達(dá)，CD34極低表達(dá)。脂肪干細(xì)胞經(jīng)低溫凍存3個(gè)月，復(fù)蘇后，生長活力和存活率與凍存前未見明顯區(qū)別，CD44和CD29檢測(cè)與凍存前表達(dá)率也一致。結(jié)論建立了一種脂肪干細(xì)胞的有效分離、培養(yǎng)及保存方法，并對(duì)其表面標(biāo)志物進(jìn)行鑒定，為利用脂肪干細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究提供了依據(jù)。

脂肪干細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)；表面標(biāo)志物；鑒定；凍存

脂肪干細(xì)胞(Adipose derived mesenchymal stem cells，ADMSCs)[1]，具有來源豐富、創(chuàng)傷小、易獲取、增殖快，可以塑形及免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)，受到越來越多的重視，因此，脂肪干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及保存逐漸成為一項(xiàng)重要技術(shù)。本文對(duì)大鼠ADMSCs進(jìn)行分離培養(yǎng)，并對(duì)其表面標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)及凍存復(fù)蘇前后標(biāo)志物的變化進(jìn)行研究，為今后進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑及儀器 清潔級(jí)近交系SD雄性大鼠3只，4周齡，體重100～150 g。由四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。主要的試劑見表1。儀器有相差倒置顯微鏡(Olympus公司，日本)；熒光顯微鏡(Bio-Rad公司，美國)；流式細(xì)胞分析儀(Thermo公司，美國)。

表1 實(shí)驗(yàn)使用的主要試劑情況表

1.2 ADMSCs的分離與培養(yǎng) 取SD大鼠，25%烏拉坦(0.25 g/kg)腹腔麻醉后頸椎脫臼法處死，置于75%的乙醇中浸泡10 min；無菌條件下取出腹股溝皮下脂肪，PBS沖洗3次后，用眼科剪剪碎；加入2～3倍體積的1 g/LⅠ型膠原酶，用移液管移至試管中，置于37℃恒溫箱中30 min，每隔5～10 min振蕩1次；30 min后，加入等量含10%FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基，常溫下以離心加速度800 g離心5 min；將上清液輕輕吸出，將細(xì)胞沉淀用DMEM培養(yǎng)液(含10%FBS)重懸并稀釋至5倍，用70 μm濾網(wǎng)過濾，以便除去其中未消化的組織。細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml。在10 cm×10 cm的培養(yǎng)皿中接種，將培養(yǎng)皿培養(yǎng)在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。第一次換液在24～48 h進(jìn)行，此后每2～3 d換液，待細(xì)胞生長融合達(dá)80%～90%時(shí)(5～7 d)，進(jìn)行消化傳代(消化溶液為0.02%EDTA和0.25%胰蛋白酶按2:1混合而成)。用相差倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 收集第4代細(xì)胞，用PBS液洗滌脂肪干細(xì)胞3次后，分成6組。每組細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/ml。分別加入相應(yīng)飽和濃度的單克隆抗體。以加入相應(yīng)體積的PBS液作為空白對(duì)照組。具體見表2。用流式細(xì)胞儀作細(xì)胞表型的檢測(cè)。

表2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)相應(yīng)單克隆抗體

1.4 ADMSCs的凍存與復(fù)蘇 第三代脂肪干細(xì)胞經(jīng)消化后，放入離心機(jī)中，以1 000 r/min離心5 min，輕輕吸出上清液。加入按含DMSO：胎牛血清：基礎(chǔ)培養(yǎng)液=1:3:6配制的凍存液，以1×105/ml左右調(diào)整細(xì)胞密度，并以凍存管保存。然后以下列順序進(jìn)行保存：4℃冰箱1 h→-20℃冰箱1 h→-80℃冰箱過夜→液氮罐中保存。3個(gè)月后，取凍存的第3代ASCs，常溫快速融化，將其復(fù)蘇。以離心管裝細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，輕輕吸出上清液。再以15 ml培養(yǎng)液吹打重懸細(xì)胞沉淀，再以上述方式離心并吸出上清液。加適當(dāng)培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后觀察復(fù)蘇后細(xì)胞的形態(tài)及生長情況，并進(jìn)行存活率測(cè)定(即用0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液測(cè)定細(xì)胞拒染百分比)。CD44、CD29表達(dá)情況的檢測(cè)如前述。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 初次接種細(xì)胞時(shí)，培養(yǎng)物中?？梢娚倭考t細(xì)胞，但這些紅細(xì)胞數(shù)量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長和換液次數(shù)的增多而逐漸清除。原代培養(yǎng)約24 h，少量細(xì)胞開始貼壁，并伸展，多數(shù)貼壁細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，呈小圓形或小多角形。有細(xì)小的突起伸出，核居中，可有1～2個(gè)核仁。48 h后可見較多貼壁細(xì)胞，未貼壁細(xì)胞經(jīng)換液除去后，可見大部分貼壁細(xì)胞呈長梭形，較為扁平，仍可見個(gè)別折光率較高的小圓形或卵圓形細(xì)胞(圖1)；5～7 d后，融合細(xì)胞呈單層排列，可覆蓋85%以上，并向著一定方向生長，但其中仍混有個(gè)別卵圓形及圓形細(xì)胞(圖2)。消化傳代后，細(xì)胞生長速度較原代明顯增快，2～3 d即可覆蓋約85%以上(傳代后細(xì)胞形態(tài)見圖3)。

圖1 接種后48 h，脂肪干細(xì)胞形態(tài)（倒置相差顯微鏡，×10）；圖2接種6 d后，脂肪干細(xì)胞形態(tài)（倒置相差顯微鏡，×20）；圖3消化傳代后細(xì)胞形態(tài)（倒置相差顯微鏡，×40）

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果 CD44、CD29呈高表達(dá)(圖4、圖5)，CD105、CD73中等程度表達(dá)(圖6、圖7)，CD34呈極低表達(dá)(圖8)。

2.3 脂肪干細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇 經(jīng)上述方法凍存復(fù)蘇后的第3代脂肪干細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)和生長狀態(tài)良好(圖9)，與凍存前無明顯區(qū)別。0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液測(cè)定細(xì)胞拒染百分比(即存活率測(cè)定)為80%。CD44陽性率為95.8%，與凍存前流式細(xì)胞儀結(jié)果對(duì)比如表3，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理顯示，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CD29陽性率為99.5%，與凍存前流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果比較見表4，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理顯示，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。培養(yǎng)3 d后傳代，其增殖能力與凍存前相比，無明顯改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用兩樣本率等效χ2檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)SPSS18.0處理，χ2=54.913，P＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可認(rèn)為凍存前檢測(cè)結(jié)果與凍存后檢驗(yàn)結(jié)果等效，即一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用兩樣本率等效χ2檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)SPSS18.0處理，χ2=11.577，P＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可認(rèn)為凍存前檢測(cè)結(jié)果與凍存后檢驗(yàn)結(jié)果等效，即一致。

CD29表達(dá)率為99.3% CD44陽性表達(dá)率為94.5% CD105陽性表達(dá)率為73% CD73陽性表達(dá)率為74.7% CD34陽性表達(dá)率為1.1%

圖9 經(jīng)凍存復(fù)蘇后細(xì)胞生長狀態(tài)良好，3 d后即可傳代

表3 凍存前后CD44表達(dá)情況對(duì)比表

表4 凍存前后CD29表達(dá)情況對(duì)比表

3 討論

目前，移植具有良好功能的細(xì)胞的細(xì)胞移植是治療終末期器官功能損害的研究熱點(diǎn)之一。具有可向多個(gè)胚層細(xì)胞分化的潛能及良好的自身復(fù)制功能的干細(xì)胞，已逐漸稱為細(xì)胞移植最理想的種子細(xì)胞[1-3]。

自從2001年Zuk等[4]首次通過吸脂術(shù)抽取脂肪組織懸液培養(yǎng)出多能干細(xì)胞，ADSCs因其取材方便，對(duì)供體創(chuàng)傷小，一次取材獲取的細(xì)胞數(shù)量大，免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)成為近年來干細(xì)胞的研究熱點(diǎn)[5-6]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)脂肪干細(xì)胞進(jìn)行分離、培養(yǎng)和保存，并對(duì)其凍存前后的細(xì)胞標(biāo)識(shí)進(jìn)行研究，為今后的研究提供研究基礎(chǔ)。

目前的研究發(fā)現(xiàn)[7-11]，脂肪干細(xì)胞主要表面標(biāo)志有：CD29(+)、CD44(+)、CD59(+)、CD105(+)、CD166(+)、CD14(-)、CD34(-)、CD38(-)、CD45(-)、CD117(-)等，我們的研究也作了一定探討，研究結(jié)果顯示：CD44、CD29高表達(dá)，CD105、CD73中等程度表達(dá)與文獻(xiàn)報(bào)道一致，說明脂肪干細(xì)胞分離培養(yǎng)成功。本實(shí)驗(yàn)選取大鼠腹股溝脂肪組織，從中分離出干細(xì)胞，由于脂肪組織中含有結(jié)締組織及血管組織，內(nèi)皮標(biāo)記CD34陽性表達(dá)率為0.6%，可能提示細(xì)胞成分不純，但極低表達(dá)，可根據(jù)后續(xù)試驗(yàn)需要進(jìn)行處理，必要時(shí)再次純化，以得到較多所需細(xì)胞。

本實(shí)驗(yàn)初次接種細(xì)胞時(shí)，有少量紅細(xì)胞混在正常培養(yǎng)細(xì)胞中，由于紅細(xì)胞具有不貼附于塑料培養(yǎng)皿生長的特性，2～3次換液后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，紅細(xì)胞基本被清除，不需要特殊處理，即可獲得較好的效果，減少了雜質(zhì)的帶入，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12]。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)初次分離培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞和凍存3個(gè)月后復(fù)蘇的脂肪干細(xì)胞進(jìn)行了對(duì)比研究，結(jié)果顯示第3代脂肪干細(xì)胞凍存3個(gè)月后復(fù)蘇，復(fù)蘇前后的細(xì)胞形態(tài)和生長狀態(tài)無明顯改變。存活率測(cè)定(0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液測(cè)定細(xì)胞拒染百分比)結(jié)果為80%。CD44流式細(xì)胞儀檢測(cè)陽性率95.8%，而凍存前流式細(xì)胞儀檢測(cè)陽性率為94.5%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用兩樣本率等效χ2檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)SPSS18.0處理，χ2=54.913，P＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可認(rèn)為凍存前檢測(cè)結(jié)果與凍存后檢驗(yàn)結(jié)果一致，即凍存前后CD44陽性表達(dá)率無差別。CD29流式細(xì)胞儀檢測(cè)陽性率為99.5%，而凍存前流式細(xì)胞儀檢測(cè)陽性率為99.3%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用兩樣本率等效χ2檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)SPSS18.0處理，χ2=11.577，P＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可認(rèn)為凍存前檢測(cè)結(jié)果與凍存后檢驗(yàn)結(jié)果一致，即凍存前后CD29陽性表達(dá)率無差別。培養(yǎng)3 d后傳代，其增殖能力與凍存前相比，無明顯改變?？傊?，經(jīng)適當(dāng)凍存的脂肪干細(xì)胞生長能力、增殖能力與凍存前一致，這與文獻(xiàn)研究一致[12-14]。CD44、CD29表面標(biāo)識(shí)表達(dá)陽性率也無差別。因此，經(jīng)適當(dāng)凍存的脂肪干細(xì)胞可以用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

總之，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)在大鼠腹股溝脂肪組織中含有大量可為細(xì)胞移植所用的種子細(xì)胞，確立一種經(jīng)濟(jì)簡便的實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)及保存ADMSCs的方法，為以后ADMSCs的大量擴(kuò)增及進(jìn)一步研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[1]項(xiàng) 飛, 鑫,黃 悅,等.大鼠急性心肌梗死的組織病理學(xué)變化及干細(xì)胞治療[J].江蘇醫(yī)藥,2008,34(5):481-483.

[2]張 雯,陳香宇,何巧玉,等.經(jīng)不同方式移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療肝纖維化的療效[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2013,29(6):889-891.

[3]胡振順,楊新明,王耀一,等.以帶蒂筋膜瓣為膜引導(dǎo)骨再生屏障膜包裹接種自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的非細(xì)胞型組織工程促進(jìn)骨缺損修復(fù)的研究[J].2012,28(4):555-557.

[4]Zuk PA,Zhu M,Mizuno H,et al.Multilineage cells from human adipose tissue:implications for cell based therapies[J].Tissue Eng, 2001,7:211-228.

[5]鄒雅琴,張培華.體外擴(kuò)增和純化脂肪干細(xì)胞應(yīng)用于自體脂肪移植的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2012,18(22):3754-3756.

[6]李 義.脂肪干細(xì)胞的在整形美容外科的應(yīng)用[J].醫(yī)學(xué)美學(xué)美容:中旬刊,2013,22(4):65-66.

[7]周紫微,趙 宇.脂肪干細(xì)胞研究進(jìn)展與應(yīng)用前景[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2013,48(7):846-849.

[8]王兆杰.軟骨組織工程中脂肪來源的多能干細(xì)胞的研究進(jìn)展[J].西部醫(yī)學(xué),2009,21(8):1257-1259.

[9]吳海濤.脂肪干細(xì)胞研究進(jìn)展[J].衛(wèi)生職業(yè)教育,2012,30(24): 157-159.

[10]金 杰,虞渝生.脂肪細(xì)胞研究進(jìn)展[J].浙江醫(yī)學(xué),2009,30(1): 101-103.

[11]雷蕙嘉,孫建軍,彭本剛,等.大鼠脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定的初步研究[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2011,15(8):1245-1248.

[12]張 亞,王曉東,馮 林,等.大鼠脂肪組織來源的干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)[J].江蘇醫(yī)藥,2007,33(12):1239-1241.

[13]樊 艷,張衛(wèi)澤,陳永清,等.成人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞凍存前后的生物學(xué)特性[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2008,12(25):4882-4886.

[14]劉廣鵬,李宇琳,孫 劍,等.低溫凍存對(duì)人脂肪來源干細(xì)胞成骨能力影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].干細(xì)胞與組織工程,2010,24(10):1224-1227.

Isolation,cultivation,identify and cryopreservation of mesenchymal stem cells from rat adipose tissue in vitro.

LV Chun-yan1,CHEN Gao-li2,YANG Ling2,CHEN Chang-jin3,YUAN Hui3,YANG Xue-mei3.
1.Department of Pathology,the Fifth People's Hospital of Chengdu,Chengdu 611130,Sichuan,CHINA;2.Department of Laboratory, Affiliated Hospital to Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 610072,Sichuan,CHINA;3.Central Laboratory,Affiliated Hospital to Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 610072,Sichuan,CHINA

ObjectiveTo search a method for isolation,cultivation,identification and cryopreservation of mesenchymal stem cells from rat adipose tissue in vitro.Method Three rats was anaesthetized and disinfected conventionally,their inguinal adipose tissue were taken and sheared to paste.The fragments were digested by collagenase typeⅠ,suspended by DMEM,and planted in culture dish.Then the cells were cultured in incubator culture.Their first medium change happen after 24～48 hours，then the change occur 2～3 days once again，after 5～7 days and 80%cell fusion,cells were digested by Trypsin and passaged by EDTA.Cell microscopy was used to morphological observation and the third generation was used to identify by flow cytometric cell cycle.ResultsRats fat had a large amount of adipose-derived mesenchymal stem cells(ADMSCs).The shape of primary culturedASCs was a star or much horn;after passage of the ASCs relatively uniform shape，fusiform shape，spiral growth.The ASCs surface markers are identified by flow cytometry and showed positive expression of CD44,CD106.Cryopreserved ASCs remains a good activity, high survival rate.Conclusion A simple and convenient method was successfully established to isolate,culture and store the adipose tissue derived mesenchymal stem cells,which provides the foundation for the future use of ADMSCs in the further research.

Adipose-derived stem cells;Cell culture;Surface marker;Identification;Cryopreservation

R-332

A

1003—6350（2014）09—1256—04

2013-11-13)