炮制對(duì)山茱萸有效成分的影響研究

宋 嬿毛春芹朱俊杰周 淵許金國(guó)池玉梅陸兔林*

（1 上海華宇藥業(yè)有限公司，上海 200237；2 南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023）

炮制對(duì)山茱萸有效成分的影響研究

宋 嬿1毛春芹2朱俊杰1周 淵2許金國(guó)2池玉梅2陸兔林2*

（1 上海華宇藥業(yè)有限公司，上海 200237；2 南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023）

目的 測(cè)定和分析山茱萸及其不同炮制品中馬錢苷、莫諾苷、5-羥甲基糠醛、沒食子酸、多糖、總黃酮、水溶性皂苷和有機(jī)酸的含量，評(píng)價(jià)炮制對(duì)山茱萸效應(yīng)物質(zhì)的影響。方法 采用高效液相色譜法測(cè)定山茱萸不同飲片中馬錢苷、莫諾苷、5-羥甲基糠醛和沒食子酸的含量，采用比色法測(cè)定山茱萸不同飲片中多糖、總黃酮和水溶性皂苷的含量，采用酸堿滴定法測(cè)定山茱萸不同飲片中有機(jī)酸的含量。結(jié)果 山茱萸經(jīng)炮制后所測(cè)成分的含量都有不同程度的變化，除莫諾苷外，高壓蒸制品所測(cè)成分的含量均略高于常壓蒸制品，但均無顯著性差異。結(jié)論 高壓蒸制工藝優(yōu)于常壓蒸制工藝，測(cè)定結(jié)果可為制定山茱萸最佳炮制工藝提供科學(xué)的依據(jù)。

山茱萸；炮制；多組分分析；效應(yīng)物質(zhì)；馬錢苷；色譜法

山茱萸為山茱萸科植物山茱萸（cornus officinalis）的干燥成熟果肉，酸澀、微溫、歸肝、腎經(jīng)，具有補(bǔ)益肝腎和收澀固脫的功效，用于眩暈耳鳴、腰膝酸痛、陽(yáng)痿遺精、遺尿尿頻、崩漏帶下、大汗虛脫、內(nèi)熱消渴等癥[1]。現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道[2-4]，山茱萸主要含有馬錢苷、沒食子酸、熊果酸、齊墩果酸、多糖等成分，具有降低血糖、增強(qiáng)免疫、抗炎等藥理作用。

山茱萸臨床及制劑使用多用其炮制品，其傳統(tǒng)炮制方法繁多，有酒制、蒸制、醋制、鹽制等[5]，近代炮制方法主要有清蒸和酒蒸，其中酒蒸被藥典收載。山茱萸生用斂陰止汗力強(qiáng)，酒制后增強(qiáng)補(bǔ)腎澀精和固精縮尿功效，酒制后借酒力溫通，助藥勢(shì)，降低其酸性，滋補(bǔ)作用更強(qiáng)[6]。但是目前山茱萸的炮制還大多采用傳統(tǒng)的常壓蒸制工藝，生產(chǎn)效率低、蒸制時(shí)間長(zhǎng)、資源浪費(fèi)大、炮制參數(shù)不易控制，導(dǎo)致制得的飲片質(zhì)量難以控制。而高壓蒸制方法使用先進(jìn)設(shè)備，使炮制參數(shù)得到控制，資源利用率升高，生產(chǎn)效率提高。但不同炮制方法對(duì)山茱萸中化學(xué)成分的影響缺乏系統(tǒng)的研究，鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究首次對(duì)山茱萸生品、常壓蒸制品和高壓蒸制品中的馬錢苷、莫諾苷、5-羥甲基糠醛、沒食子酸、多糖、總黃酮、水溶性皂苷和有機(jī)酸的含量進(jìn)行系統(tǒng)的比較分析，確定山茱萸最佳炮制方法，為制定山茱萸最佳炮制工藝標(biāo)準(zhǔn)和進(jìn)一步研究其藥效物質(zhì)提供科學(xué)的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 藥品與試劑

馬錢苷（批號(hào)：111640-200502），莫諾苷（批號(hào)：110786-200403），5-羥甲基糠醛（批號(hào)：110753-200212），蘆丁（批號(hào)：100080-200306），熊果酸（批號(hào)：110742-200516），沒食子酸（批號(hào)：110831-200302），均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，供含量測(cè)定用，葡萄糖（惠興生化試劑有限公司）。乙腈、甲醇為色譜純，其余所有試劑均為分析純。山茱萸飲片購(gòu)自安徽豐原銅陵中藥飲片有限公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定為山茱萸科植物山茱萸（Cornus officinalis Sieb.et Zucc）的干燥成熟果肉。

1.2 儀器

Agilent 1100型高效液相色譜系統(tǒng)（安捷倫科技有限公司），配有四元梯度泵、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、UV檢測(cè)器，CP225D微量天平（德國(guó)Sartorius），熱壓滅菌柜（日本三洋電機(jī)公司），KQ-500E型醫(yī)用超聲清洗器（昆山超聲儀器有限公司），752型紫外可見分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司），電子天平（Mettler Toledo AG285），數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-4（國(guó)華電器有限公司），F(xiàn)W100型高速萬能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司），1810-B型石英自動(dòng)雙重純水蒸餾器（江蘇金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠）。

1.3 色譜條件

馬錢苷及莫諾苷、5-羥甲基糠醛、沒食子酸含量測(cè)定色譜柱為Kromasil-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相分別為乙腈-水（15∶85，V/V）、乙腈-水（5∶95，V/V）、甲醇-0.1%磷酸（8∶92，V/V），檢測(cè)波長(zhǎng)分別為240、240、271 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃。

圖1 山茱萸飲片中馬錢苷和莫諾苷的含量測(cè)定色譜圖（A：對(duì)照品；B：供試品-1.馬錢苷，2.莫諾苷）

圖3 山茱萸飲片中沒食子酸的含量測(cè)定色譜圖（A：對(duì)照品；B：供試品）

圖3 山茱萸飲片中沒食子酸的含量測(cè)定色譜圖（A：對(duì)照品；B：供試品）

1.4 山茱萸飲片的制備

取凈山茱萸飲片100 g，加入黃酒拌勻（黃酒用量為20%），密閉，悶潤(rùn)1 h，置蒸鍋中蒸制6 h，取出，60 ℃干燥，即得山茱萸常壓蒸制品。取凈山茱萸飲片100 g，加入黃酒拌勻（黃酒用量為20%），密閉，悶潤(rùn)1 h，置熱壓滅菌柜105 ℃蒸制1.5 h，取出，60 ℃干燥，即得高壓蒸制品。

1.5 溶液的配制

1.5.1 馬錢苷、莫諾苷對(duì)照品溶液的制備：精密稱定馬錢苷、莫諾苷對(duì)照品適量，加80%甲醇分別制成單一對(duì)照品儲(chǔ)備液；另精密吸取單一對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用80%甲醇稀釋成每1 mL含馬錢苷60.22 μg和莫諾苷71.85 μg的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用。供試品溶液的制備：取山茱萸常壓蒸制飲片，粉碎，過三號(hào)篩，精密稱取粉末0.1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，稱重，超聲提?。üβ?50 W，頻率20 kHz）25 min，放冷，再稱定重量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，15 600×g離心10 min，即得。

1.5.2 5-羥甲基糠醛對(duì)照品溶液的制備：精密稱定5-羥甲基糠醛對(duì)照品適量，加80%甲醇制成每1 mL含5-羥甲基糠醛34.80 μg的對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用。供試品溶液的制備：同“溶液的配制”項(xiàng)下“1.5.1”中的“供試品溶液的制備”。

1.5.3 沒食子酸含量測(cè)定溶液的配制。①對(duì)照品溶液的制備：精密稱定沒食子酸對(duì)照品適量，加80%甲醇制成每1 mL含沒食子酸126.8 μg的對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用。②供試品溶液的制備：同“溶液的配制”項(xiàng)下“1.5.1”中的“供試品溶液的制備”。

1.5.4 多糖含量測(cè)定溶液的配制：①對(duì)照品溶液的制備：精密稱取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖適量，加水制成每1 mL含葡萄糖0.192 mg的對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用。②供試品溶液的制備：取山茱萸常壓蒸制飲片，粉碎，過三號(hào)篩，精密稱取粉末5.0 g，加10倍量95%的乙醇回流2 h脫脂，過濾，藥渣用20倍量水回流提取2次，每次1.5 h，過濾，合并濾液，濃縮，加95%乙醇至濃縮液含醇量達(dá)到80%，冷置24 h，過濾，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，取出沉淀加水溶解并定容至250 mL，再精密吸取該溶液1.0 mL，于刻度試管中，精密加5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻后再精密加濃硫酸8.0 mL，混勻，沸水浴中加熱30 min，迅速取出冰水浴冷卻10 min，取出至室溫，即得。

1.5.5 總黃酮含量測(cè)定溶液的配制：①對(duì)照品溶液的制備：精密稱取蘆丁對(duì)照品適量，用60%乙醇制成每1 mL含蘆丁0.220 mg的對(duì)照品儲(chǔ)備液。②供試品溶液的制備：取山茱萸常壓蒸制飲片，粉碎，過60目篩，精密稱取粉末1.0 g，加60%乙醇20 mL，90 ℃恒溫振蕩2 h，1980×g離心15 min，上清液置于50 mL量瓶中，用少量60%乙醇洗滌殘?jiān)?，洗液與上清液合并用60%乙醇定容至刻度。再精密吸取1.0 mL，精密加入5% NaNO21.0 mL，搖勻，5 min后精密加入10% Al（NO3）31.0 mL，搖勻，6 min后精密加入4% NaOH 5.0 mL，搖勻，即得。

1.5.6 水溶性皂苷含量測(cè)定溶液的配制：①對(duì)照品溶液的制備：精密稱取熊果酸對(duì)照品適量，用70%乙醇制成每1 mL含熊果酸0.161 mg的對(duì)照品儲(chǔ)備液。②供試品溶液的制備：取山茱萸常壓蒸制飲片，粉碎，過60目篩，精密稱取粉末2.0 g，加100 mL 70%乙醇，回流提取1 h，濾過，75 ℃水浴控溫，過濾，回收至無醇味，加3～4倍量的蒸餾水，冷置24 h，離心，取上清夜，濃縮、定容至25 mL，作為供試品溶液，再精密吸取1.0 mL，水浴揮干溶劑，精密加入5%香草醛-冰醋酸0.5 mL和高氯酸0.8 mL，65 ℃水浴加熱20 min，取出置冰水浴中冷卻后，加冰醋酸5 mL，搖勻，即得。

1.5.7 總有機(jī)酸含量測(cè)定溶液的配制：①1%酚酞指示劑的制備：稱取酚酞1 g，無水乙醇溶解制成1%酚酞指示劑，4 ℃保存，備用。0.1 mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)液的制備：稱取NaOH 4 g，用蒸餾水溶解制成1 L，并用鄰苯二甲酸氫鉀標(biāo)定，確定其準(zhǔn)確濃度為0.1004 mol/L，4 ℃保存，備用。②供試品溶液的制備：取山茱萸常壓蒸制飲片，粉碎，過60目篩，稱取粉末10 g，加100 mL無二氧化碳蒸餾水混勻，75 ℃水浴提取30 min，過濾，濾液用無二氧化碳蒸餾水定容至250 mL量瓶中，取200 mL溶液加10%活性碳，70 ℃水浴加熱脫色20 min，過濾，濾液定容至200 mL，即得。

2 結(jié) 果

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)

分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果在相應(yīng)的色譜條件下，馬錢苷及莫諾苷、5-羥甲基糠醛、沒食子酸與其他成分均能達(dá)到基線分離，其保留時(shí)間分別為6.8、8.7、9.2和9.2 min，分離度均＞1.5，理論板數(shù)均不低于5 000。色譜圖見圖1～圖3。

2.2 山茱萸中馬錢苷、莫諾苷含量測(cè)定

①線性關(guān)系考察：分別精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液1、2、4、6、8、10 mL，置10 mL量瓶中，用80%甲醇稀釋定容至刻度，分別進(jìn)樣10 μL，測(cè)定馬錢苷和莫諾苷的峰面積值。以峰面積值為縱坐標(biāo)，對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明馬錢苷和莫諾苷在各自的線性范圍（分別為6.022～60.22和7.185～71.85 μg/mL）內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程分別為y=26.947 1x-2.810 4和y=12.2479x+6.060 0，r分別為0.999 7和0.999 9。②精密度實(shí)驗(yàn)：取馬錢苷和莫諾苷質(zhì)量濃度分別為36.13和43.11 μg/mL的混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定馬錢苷和莫諾苷的峰面積，二者峰面積的RSD值分別為0.40%和0.32%。表明儀器精密度良好。③重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：取同一飲片粉末，按“溶液的配制”項(xiàng)下“1.5.1”制備成供試品溶液，平行實(shí)驗(yàn)5份，測(cè)定馬錢苷和莫諾苷的峰面積并計(jì)算含量。馬錢苷和莫諾苷的平均百分含量（RSD）為0.53%（1.46%）和1.06%（2.69%），表明方法重復(fù)性良好。④穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于0、4、8、12、24 h測(cè)定馬錢苷和莫諾苷的峰面積，二者不同時(shí)間峰面積的RSD分別為1.38%和1.74%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。⑤準(zhǔn)確度試驗(yàn)：分別精密稱取馬錢苷和莫諾苷對(duì)照品適量，用80%甲醇配制成每1 mL含馬錢苷0.262 mg和莫諾苷0.520 mg的混合對(duì)照品溶液，備用。另精密稱取飲片粉末0.05 g，共9份，分別按樣品中馬錢苷含量的80%、100%和120%加入混合對(duì)照品溶液0.8、1.0和1.2 mL，各3份，按“溶液的配制”項(xiàng)下“1.5.1”制備成供試品溶液，測(cè)定二者峰面積并計(jì)算含量，根據(jù)測(cè)得量和加入量計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示馬錢苷和莫諾苷的平均加樣回收率（RSD）分別為100.26%（1.17%）和100.33%（1.24%）。⑥樣品測(cè)定：取山茱萸三種飲片，粉碎，過三號(hào)篩，精密稱取各粉末1.0 g，按“溶液的配制”項(xiàng)下“1.5.1”制備成供試品溶液，按上述色譜條件，測(cè)定各樣品中馬錢苷和莫諾苷的含量。結(jié)果見表1。

表1 山茱萸飲片中被測(cè)成分的測(cè)定結(jié)果（n=3，%）

2.3 山茱萸中5-羥甲基糠醛含量測(cè)定

①線性關(guān)系考察：分別精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液1、2、4、6、8、10 mL于10 mL量瓶中，用80%甲醇稀釋定容至刻度。分別進(jìn)樣10 μL，測(cè)定5-羥甲基糠醛的峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明5-羥甲基糠醛在3.480～34.80 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，回歸方程為y=207.2732x + 10.3948，r=0.999 8。②精密度實(shí)驗(yàn)：取5-羥甲基糠醛質(zhì)量濃度為13.92 μg/mL對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定5-羥甲基糠醛的峰面積并計(jì)算RSD，其RSD值為0.85%，表明儀器精密度良好。③重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：取同一飲片粉末，按“溶液的配制”項(xiàng)下“1.5.1”制備成供試品溶液，平行實(shí)驗(yàn)5份，測(cè)定5-羥甲基糠醛的峰面積并計(jì)算含量。5-羥甲基糠醛的平均百分含量（RSD）為0.36%（1.32%），表明方法重復(fù)性良好。④穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于0、4、8、12、24 h測(cè)定5-羥甲基糠醛的峰面積，其不同時(shí)間峰面積的RSD為1.67%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。⑤準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)：精密稱取5-羥甲基糠醛對(duì)照品適量，用80%甲醇配制成每1 mL含5-羥甲基糠醛0.178 mg的對(duì)照品溶液，備用。另精密稱取飲片粉末0.05 g，共9份，按樣品中5-羥甲基糠醛含量的80%、100%和120%加入對(duì)照品溶液0.8、1.0和1.2 mL，各3份，按“溶液的配制”項(xiàng)下“1.5.1”制備成供試品溶液，測(cè)定峰面積并計(jì)算含量，根據(jù)測(cè)得量和加入量計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示5-羥甲基糠醛的平均加樣回收率（RSD）為99.99%（0.73%）。⑥樣品測(cè)定：取山茱萸三種飲片，粉碎，過三號(hào)篩，精密稱取各粉末1.0 g，按“溶液的配制”項(xiàng)下“1.5.1”制備成供試品溶液，按上述色譜條件，測(cè)定各樣品中5-羥甲基糠醛的含量。結(jié)果見表1。

2.4 山茱萸中沒食子酸含量測(cè)定

①線性關(guān)系考察：分別精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.05、1、2、4、8、10 mL于10 mL量瓶中，用80%甲醇稀釋定容至刻度。分別進(jìn)樣10 μL，測(cè)定沒食子酸的峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明沒食子酸在6.340～126.8 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，回歸方程為y=42.491 5x+ 14.599 8，r=0.999 9。②精密度實(shí)驗(yàn)：取沒食子酸濃度為50.72 μg/mL的對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定沒食子酸的峰面積并計(jì)算RSD，其RSD值為0.75%，表明儀器精密度良好。③重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：取同一飲片粉末，按“溶液的配制”項(xiàng)下“1.5.1”制備成供試品溶液，平行實(shí)驗(yàn)5份，測(cè)定沒食子酸的峰面積并計(jì)算含量。沒食子酸的平均百分含量（RSD）為1.32%（0.43%），表明方法重復(fù)性良好。④穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于0、4、8、12、24 h測(cè)定沒食子酸的峰面積，其不同時(shí)間峰面積的RSD為0.60%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。⑤準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)：精密稱取沒食子酸對(duì)照品適量，用80%甲醇配制成每1 mL含沒食子酸0.656 mg的對(duì)照品溶液，備用。另精密稱取飲片粉末0.05 g，共9份，按樣品中沒食子酸含量的80%、100%和120%加入對(duì)照品溶液0.8、1.0和1.2 mL，各3份，按“溶液的配制”項(xiàng)下“1.5.1”制備成供試品溶液，測(cè)定峰面積并計(jì)算含量，根據(jù)測(cè)得量和加入量計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示沒食子酸的平均加樣回收率（RSD）為100.02%（0.80%）。⑥樣品測(cè)定：取山茱萸三種飲片，粉碎，過三號(hào)篩，精密稱取各粉末1.0 g，按“溶液的配制”項(xiàng)下“1.5.1”制備成供試品溶液，按上述色譜條件，測(cè)定各樣品中沒食子酸的含量。結(jié)果見表1。

2.5 山茱萸中多糖含量測(cè)定

①線性關(guān)系考察：分別精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液3、4、5、6、7、8 mL于10 mL量瓶中，用水稀釋定容至刻度。精密吸取1.0 mL對(duì)照品溶液，于刻度試管中，精密加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻后再精密加入濃硫酸8.0 mL，混勻，沸水浴中加熱30 min，迅速取出冰水浴冷卻10 min，取出至室溫，在480 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明葡萄糖在0.058～0.154 mg/mL范圍內(nèi)線性良好，回歸方程為y=4.124 8x+0.0198，r=0.9975。②精密度實(shí)驗(yàn)：取葡萄糖濃度為0.096 mg/mL的對(duì)照品溶液，連續(xù)測(cè)定5次，測(cè)定葡萄糖的吸光度并計(jì)算RSD，其RSD值為0.17%，表明儀器精密度良好。③重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：取同一飲片粉末，按“溶液的配制”項(xiàng)下“1.5.4”制備成供試品溶液，平行實(shí)驗(yàn)5份，測(cè)定供試品溶液的吸光度并計(jì)算多糖含量。多糖的平均百分含量（RSD）為4.69%（1.40%），表明方法重復(fù)性良好。④穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于0、4、8、12、24 h測(cè)定供試品溶液的吸光度，其不同時(shí)間吸光度的RSD為1.08%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。⑤準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)：精密稱取葡萄糖對(duì)照品適量，用水配制成每1 mL含葡萄糖117.5 mg的對(duì)照品溶液，備用。另精密稱取飲片粉末2.5 g，共9份，按樣品中多糖含量的80%、100%和120%加入對(duì)照品溶液0.8、1.0和1.2 mL，各3份，按“溶液的配制”項(xiàng)下“1.5.4”制備成供試品溶液，測(cè)定吸光度并計(jì)算含量，根據(jù)測(cè)得量和加入量計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示多糖的平均加樣回收率（RSD）為99.72%（0.34%）。⑥樣品測(cè)定：取山茱萸三種飲片，粉碎，過三號(hào)篩，精密稱取各粉末5.0 g，按“溶液的配制”項(xiàng)下“1.5.4”制備成供試品溶液，在480 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算各樣品中多糖的含量。結(jié)果見表1。

2.6 山茱萸中總黃酮含量測(cè)定

①線性關(guān)系考察：分別精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液3、4、5、6、7、8 mL于10 mL量瓶中，用60%乙醇稀釋定容至刻度。精密吸取1.0 mL對(duì)照品溶液，于刻度試管中，精密加入5% NaNO21.0 mL，搖勻，5 min后精密加入10% Al（NO3）31.0 mL，搖勻，6 min后精密加入4% NaOH 5.0 mL，搖勻，于500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明蘆丁在0.066～0.176 mg/mL范圍內(nèi)線性良好，回歸方程為y=4.114 3x-0.0602，r=0.997 7。②精密度實(shí)驗(yàn)：取蘆丁濃度為0.132 mg/mL的對(duì)照品溶液，連續(xù)測(cè)定5次，測(cè)定蘆丁的吸光度并計(jì)算RSD，其RSD值為0.42%，表明儀器精密度良好。③重復(fù)性試驗(yàn)：取同一飲片粉末，按“溶液的配制”項(xiàng)下“1.5.5”制備成供試品溶液，平行試驗(yàn)5份，測(cè)定供試品溶液的吸光度并計(jì)算總黃酮的含量?？傸S酮的平均百分含量（RSD）為5.56%（1.08%），表明方法重復(fù)性良好。④穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于0、4、8、12、24 h測(cè)定供試品溶液的吸光度，其不同時(shí)間吸光度的RSD為1.50%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。⑤準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)：精密稱取蘆丁對(duì)照品適量，用60%乙醇配制成每1 mL含葡萄糖27.63 mg的對(duì)照品溶液，備用。另精密稱取飲片粉末0.5 g，共9份，按樣品中多糖含量的80%、100%和120%加入對(duì)照品溶液0.8、1.0和1.2 mL，各3份，按“溶液的配制”項(xiàng)下“1.5.5”制備成供試品溶液，測(cè)定吸光度并計(jì)算含量，根據(jù)測(cè)得量和加入量計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示多糖的平均加樣回收率（RSD）為100.13%（1.29%）。⑥樣品測(cè)定：取山茱萸三種飲片，粉碎，過三號(hào)篩，精密稱取各粉末1.0 g，按“溶液的配制”項(xiàng)下1.5.5制備成供試品溶液，在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算各樣品中總黃酮的含量。結(jié)果見表1。

2.7 山茱萸中水溶性皂苷含量測(cè)定

①線性關(guān)系考察：分別精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.4、0.8、1.0、1.2、1.6、1.8 mL，水浴揮干溶劑，精密加入5%香草醛-冰醋酸0.5 mL和高氯酸0.8 mL，65 ℃水浴加熱20 min，取出置冰水浴中冷卻后，加冰醋酸5 mL，搖勻，于580 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明蘆丁在0.064～0.290 mg/mL范圍內(nèi)線性良好，回歸方程為y=2.3214x+0.0613，r=0.9987。②精密度實(shí)驗(yàn)：取熊果酸濃度為0.132 mg/mL的對(duì)照品溶液，連續(xù)測(cè)定5次，測(cè)定熊果酸的吸光度并計(jì)算RSD，其RSD值為0.44%，表明儀器精密度良好。③重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：取同一飲片粉末，按“溶液的配制”項(xiàng)下1.5.6制備成供試品溶液，平行實(shí)驗(yàn)5份，測(cè)定供試品溶液的吸光度并計(jì)算水溶性皂苷的含量。水溶性皂苷的平均百分含量（RSD）為1.26%（1.99%），表明方法重復(fù)性良好。④穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于0、4、8、12、24 h測(cè)定供試品溶液的吸光度，其不同時(shí)間吸光度的RSD為1.19%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。⑤準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)：精密稱取熊果酸對(duì)照品適量，用70%乙醇配制成每1 mL含熊果酸12.53 mg的對(duì)照品溶液，備用。另精密稱取飲片粉末0.5 g，共9份，按樣品中水溶性皂苷含量的80%、100%和120%加入對(duì)照品溶液0.8、1.0和1.2 mL，各3份，按“溶液的配制”項(xiàng)下1.5.6制備成供試品溶液，測(cè)定吸光度并計(jì)算含量，根據(jù)測(cè)得量和加入量計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示水溶性皂苷的平均加樣回收率（RSD）為100.43%（1.41%）。⑥樣品測(cè)定：取山茱萸三種飲片，粉碎，過三號(hào)篩，精密稱取各粉末1.0 g，按“溶液的配制”項(xiàng)下6制備成供試品溶液，在580 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算各樣品中水溶性皂苷的含量。結(jié)果見表1。

2.8 山茱萸中總有機(jī)酸含量測(cè)定

取山茱萸三種飲片，粉碎，過60目篩，各3份，按“溶液的配制”項(xiàng)下1.5.7制備成供試品溶液，每份再精密吸取25 mL，置150 mL錐形瓶中，加1%酚酞指示劑2滴，用0.1 mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)液滴定，滴至微紅且30 s不褪色，記錄NaOH標(biāo)準(zhǔn)液的用量。依據(jù)下面的公式計(jì)算山茱萸總有機(jī)酸含量。結(jié)果見表1?？傆袡C(jī)酸含量%=c×V×K/（m ×25/250）×100%（V：氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液體積，c：氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液濃度，m：樣品質(zhì)量，K：換算成主要酸的系數(shù)）。

3 討 論

山茱萸屬于補(bǔ)益藥物，臨床及制劑多用其炮制品。山茱萸中以馬錢苷和莫諾苷為代表的水溶性苷類，主要與其免疫調(diào)節(jié)的作用相關(guān)[7,8]；山茱萸生品和制品多糖均能明顯提高免疫低下小鼠的非特異性免疫功能、體液免疫功能和細(xì)胞免疫功能[9]；山茱萸中以沒食子酸為代表的有機(jī)酸多具有免疫調(diào)節(jié)和抗肝損傷作用等[10]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)山茱萸經(jīng)蒸制后產(chǎn)生一新成分5-羥甲基糠醛，其對(duì)CCl4肝損傷模型及血管內(nèi)皮細(xì)胞具有良好的保護(hù)作用[11]，其他一些補(bǔ)益藥蒸制后也會(huì)產(chǎn)生了5-羥甲基糠醛[12,13]，因此推測(cè)5-羥甲基糠醛是補(bǔ)益類藥物經(jīng)炮制后的一個(gè)共性成分，在飲片的質(zhì)量控制中建立該成分的含量測(cè)定，可以為研究山茱萸炮制機(jī)制提供新思路，而其產(chǎn)生的因素有待于進(jìn)一步研究。故研究山茱萸中主要效應(yīng)物質(zhì)在炮制過程中的變化，對(duì)山茱萸的炮制工藝、質(zhì)量控制及藥理藥效研究有積極作用。

根據(jù)文獻(xiàn)，本研究比較了不同濃度甲醇（60%、80%、100%）三種溶劑對(duì)馬錢苷、莫諾苷、5-羥甲基糠醛和沒食子酸的提取效率，結(jié)果顯示不同溶劑提取效率為80%甲醇＞甲醇＞60%甲醇，故以80%甲醇作為提取溶劑；考察了超聲提取法和回流提取法，結(jié)果顯示超聲提取效率和回流提取效率差別不大，但超聲提取更簡(jiǎn)便易行；同時(shí)考察了超聲時(shí)間（15、25、35 min）對(duì)提取效率的影響，結(jié)果顯示超聲提取時(shí)間25與35 min明顯高于15 min，然25與35 min之間沒有差別。所以本實(shí)驗(yàn)選擇以80%甲醇為提取溶劑，超聲提取25 min對(duì)被測(cè)成分進(jìn)行提取。

在研究過程中，考察了多個(gè)色譜條件，希望在同一色譜條件下，能夠同時(shí)對(duì)四種物質(zhì)進(jìn)行含量測(cè)定，然而實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，所有考察的色譜條件，部分成分的分離度不夠，相互干擾測(cè)定，或者山茱萸中其他成分對(duì)其有干擾，故本研究選擇了3個(gè)不同色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定，所選色譜條件均達(dá)到了含量測(cè)定的要求。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，山茱萸經(jīng)炮制后其中主要幾類有效成分含量都有不同程度的變化，并且除莫諾苷，高壓蒸制品所測(cè)成分的含量均略高于常壓蒸制品，但無顯著性差異，說明從化學(xué)成分方面分析，山茱萸高壓蒸制工藝是科學(xué)可行的，而且高壓蒸制過程中蒸制參數(shù)可以控制，生產(chǎn)效率能夠得到很大的提高。本實(shí)驗(yàn)研究可以為制定山茱萸最佳炮制工藝提供科學(xué)的依據(jù)，確保酒蒸山茱萸的質(zhì)量和臨床應(yīng)用的安全，同時(shí)為其及炮制品的藥效研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。炮制前后山茱萸中其他成分含量的變化，尚待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

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Influence of Processed on Active Substances in Cornus Officinalis Evaluated by Multi-components Analysis

SONG Yan1, MAO Chun-qin2, ZHU Jun-jie1, ZHE Yun2, XU Jin-guo1,CHI Yu-mi2, LU Tu-lin2
(1 Shanghai Huayu Pharmaceutical Company Limited, Shanghai 200237, China; 2 Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China)

Objective To determine and analyze the contents of loginan, morroniside, 5-hydroxymethyl furfural, gallic acid, polysaccharide, flavonooids, water-soluble saponins and organic acid in cornus officinalis and its different processed products to evaluate the influence of processed on active substances in cornus officinalis. Methods The contents of loginan, morroniside, 5-Hydroxymethyl furfural and gallic acid in different processed products of cornus officinalis were determined by HPLC. The contents of polysaccharide, flavonooids, water-soluble saponins in different processed products of cornus officinalis were determined by colorimetry. The contents of organic acid in different processed products of cornus officinalis were determined by acid-base titration. Results There were different changes of the components in cornus officinalis processed by different methods. The contents of the determined components in high-pressure products of Cornus officinalis were slightly higher than them in atmospheric-pressure products of cornus officinalis except morroniside, but there were not significant difference. Conculusion The high-pressure process is better than the atmospheric-pressure process. The results can provide a scientific basis for the best processing technology of cornus officinalis.

Cornus officinalis; Processing; Multi-components analysis; Effector substance; Loginan; Chromatography

R286

B

1671-8194（2014）20-0023-04

*通訊作者