地五養(yǎng)肝方對(duì)HBeAg陰性慢性乙型肝炎患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群和細(xì)胞因子的影響*

羅俊華 曹秋實(shí)

（1.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院，湖北 武漢 430070；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430061）

·臨床觀察·

地五養(yǎng)肝方對(duì)HBeAg陰性慢性乙型肝炎患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群和細(xì)胞因子的影響*

羅俊華1，2曹秋實(shí)2

（1.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院，湖北 武漢 430070；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430061）

目的觀察地五養(yǎng)肝方對(duì)HBeAg陰性慢性乙型肝炎（CHB）患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群和細(xì)胞因子的影響。方法將103例患者隨機(jī)分為對(duì)照組和治療組，對(duì)照組予以恩替卡韋治療，治療組在對(duì)照組治療基礎(chǔ)上加用地五養(yǎng)肝方。兩組共治療48周。觀察兩組患者HBV DNA轉(zhuǎn)陰率，檢測(cè)外周血細(xì)胞因子IL-17、IL-10的水平，并用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)外周血CD3+、CD4+及CD8+T淋巴細(xì)胞的表達(dá)情況。結(jié)果治療48周后，治療組患者HBV DNA轉(zhuǎn)陰率顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），CD8+水平較對(duì)照組明顯下降（P＜0.01），CD4+及CD4+/CD8+水平較對(duì)照組升高更顯著（P＜0.05），IL-17、IL-10水平較對(duì)照組降低更明顯（P＜0.05）。結(jié)論T淋巴細(xì)胞和細(xì)胞因子在HBeAg陰性CHB的發(fā)病及轉(zhuǎn)歸中起到非常重要的作用，地五養(yǎng)肝方與恩替卡韋聯(lián)用能顯著改善外周血T淋巴細(xì)胞亞群狀態(tài)，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IL-17、IL-10的水平，提高抗病毒療效。

地五養(yǎng)肝方 慢性乙型肝炎 HbeAg T淋巴細(xì)胞亞群 細(xì)胞因子

HBeAg陰性慢性乙型肝炎（CHB）相對(duì)HBeAg陽(yáng)性CHB具有病程較長(zhǎng)、病情易反復(fù)、抗病毒療效差等特征［1］，是目前研究的熱點(diǎn)之一，其病情進(jìn)展和預(yù)后與病毒水平密切相關(guān)。T淋巴細(xì)胞亞群及相關(guān)細(xì)胞因子的平衡在機(jī)體清除HBV中起到關(guān)鍵性作用［2］。研究表明，中醫(yī)中藥可以改善CHB患者免疫功能，增強(qiáng)西藥抗病毒的效果。本研究采用地五養(yǎng)肝方聯(lián)合恩替卡韋治療HBeAg陰性CHB，觀察治療前后HBV DNA、IL-17、IL-10及外周T細(xì)胞亞群的變化，探討其作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 病例選擇 納入標(biāo)準(zhǔn)：診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2011年《慢性乙型肝炎防治指南》（2010年版）［3］；6個(gè)月內(nèi)未使用干擾素及核苷類(lèi)似物、免疫抑制劑或免疫增強(qiáng)劑。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并人類(lèi)皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、HIV感染；合并藥物中毒、乙醇中毒等因素所致的肝炎及脂肪肝、自身免疫性肝炎者；同時(shí)或重疊感染甲、丙、丁、戊型肝炎病毒者。

1.2 臨床資料 收集2011年11月至2013年10月在湖北省中醫(yī)院肝病中心門(mén)診就診的HBeAg陰性CHB患者103例。將患者按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為兩組。對(duì)照組48例，男性30例，女性18例；平均年齡（38.10±13.70）歲。治療組55例，男性34例，女性21例；平均年齡（37.90±13.20）歲。兩組患者在性別、年齡、病程、肝功能等方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。所有患者對(duì)本研究均知情同意，相關(guān)程序符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)并取得醫(yī)院人體試驗(yàn)委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 治療方法 對(duì)照組給予恩替卡韋片0.5 mg/d（中美上海施貴寶制藥有限公司，商品名為博路定，批準(zhǔn)文號(hào)為國(guó)藥準(zhǔn)字H20052237，規(guī)格為0.5 mg）口服。治療組在口服恩替卡韋基礎(chǔ)上，加用地五養(yǎng)肝方（江陰天江藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)12040019，規(guī)格為10 g）口服1包/次，每日2次（早晚溫開(kāi)水沖服）。療程48周。

1.4 觀察指標(biāo) （1）肝功能及HBV DNA的檢測(cè)。肝功能檢測(cè)采用Beckman全自動(dòng)生化分析儀；HBV DNA定量采用熒光定量PCR法，由專人按照儀器操作規(guī)程和試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。試劑盒購(gòu)自武漢博士得生物工程公司。（2）IL-17及IL-10的檢測(cè)。采用ELISA法，試劑盒購(gòu)自武漢博士得生物工程公司，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。（3）T淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)。采用美國(guó)BD公司生產(chǎn)的BD FACScalibur流式細(xì)胞儀，檢測(cè)外周血T淋巴細(xì)胞亞群。采集靜脈血1 mL，肝素鈉抗凝，取流氏管分別加入靜脈抗凝全血100 μL及三色標(biāo)記的單克隆抗體（鼠抗人 CD3-FITC，CD4-APC，CD8-PE，試劑均購(gòu)自美國(guó)BD公司）20 μL，混勻室溫避光30 min后加含2.5％胎牛血清（FBS）的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）2.5 mL，離心洗去多余抗體，破紅，再次離心洗滌，棄上清，細(xì)胞以10 g/L多聚甲醛重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD3+、CD4+及CD8+T細(xì)胞亞群。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示。組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，治療前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，率的比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組治療前后肝功能比較 見(jiàn)表1。兩組治療后丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）及總膽紅素（TBIL）水平與治療前比較均顯著下降（P＜0.01）；與對(duì)照組治療后比較，治療組治療后ALT、AST及TBIL水平明顯降低（P＜0.05）。

2.2 兩組HBV DNA陰轉(zhuǎn)情況比較 治療48周后，治療組HBV DNA轉(zhuǎn)陰51例（92.7％），對(duì)照組轉(zhuǎn)陰37例（77.1％），治療組HBV DNA陰轉(zhuǎn)率明顯高于對(duì)照組（P＜ 0.05）。

表1 兩組治療前后ALT、AST及TBIL水平比較（±s）

表1 兩組治療前后ALT、AST及TBIL水平比較（±s）

與本組治療前比較，*P＜0.01；與對(duì)照組同期比較，△P＜0.05。

組 別ALT（U/L） AST（U/L）TBIL（μmol/L）治療組 治療前 43.54±23.71（n＝55）治療后 21.91±9.70*△對(duì)照組 治療前 46.88±21.57 147.93±51.32 139.85±40.77 49.52±10.32*△ 45.91±11.67*△143.53±47.22 141.16±42.69（n＝48）治療后 29.47±10.51*57.83±12.45* 54.41±13.83*

2.3 兩組治療前后外周血T淋巴細(xì)胞亞群比較 見(jiàn)表2。對(duì)照組治療后CD4+及CD4+/CD8+較治療前均顯著增加（P＜0.05），CD3+及CD8+差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療組治療后CD4+及CD4+/CD8+較治療前均顯著增加 （P＜0.01或 P＜0.05），CD8+顯著下降 （P＜0.01），CD3+差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與同期對(duì)照組比較，CD4+及CD4+/CD8+升高更明顯（P＜0.05）。

表2 兩組治療前后外周血T淋巴細(xì)胞亞群比較（±s）

表2 兩組治療前后外周血T淋巴細(xì)胞亞群比較（±s）

與本組治療前比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與對(duì)照組同期比較，△P＜0.05。下同。

組 別CD3+（％） CD4+（％） CD8+（％） CD4+/CD8+治療組 治療前（n＝55）治療后對(duì)照組 治療前65.21±16.90 29.51±5.10 35.12±5.92 0.84±0.29 67.42±11.21 41.13±6.32**△26.91±4.90**1.54±0.40*△65.53±17.47 29.31±4.66 34.74±6.16 0.83±0.35（n＝48）治療后66.76±10.55 35.61±5.40*30.81±5.64 1.16±0.32*

2.4 兩組治療前后血清細(xì)胞因子水平比較 見(jiàn)表3。兩組治療后IL-17、IL-10水平較治療前均顯著下降（P＜0.01）；與對(duì)照組治療后比較，治療組治療后IL-17、IL-10水平明顯降低（P＜0.05）。

表3 兩組治療前后IL-17及IL-10水平比較（pg/mL，±s）

表3 兩組治療前后IL-17及IL-10水平比較（pg/mL，±s）

組 別 IL-17 IL-10治療組 治療前 191.65±48.25 83.42±23.73（n＝55） 治療后 118.94±121.66**△ 47.81±14.65**△對(duì)照組 治療前 198.33±31.61 82.67±22.46（n＝48） 治療后 137.67±119.75** 58.41±16.20**

3 討論

HBV感染中HBeAg陰性感染占70％。HBeAg陰性CHB具有較高的向肝硬化、終末期肝病、肝細(xì)胞癌發(fā)展的傾向［4］，其HBV變異所引起的宿主免疫應(yīng)答的相應(yīng)變化，往往使感染后的病情進(jìn)展趨于復(fù)雜［5］。國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)，HBeAg陰性CHB患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞減少，CD8+T淋巴細(xì)胞增加，CD4+/CD8+比值下降［6-7］。CD4+淋巴細(xì)胞的數(shù)量和功能下降，直接導(dǎo)致細(xì)胞免疫功能低下，不利于宿主對(duì)病毒進(jìn)一步清除。CD8+淋巴細(xì)胞過(guò)度活化又會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重肝組織破壞。伴隨T淋巴細(xì)胞亞群失衡，CHB患者也存在細(xì)胞因子（如IL-17、IL-10等）的失調(diào)。IL-17是一種重要的促炎癥細(xì)胞因子，主要是由活化的記憶性CD4+T淋巴細(xì)胞分泌，它可以促進(jìn)機(jī)體局部產(chǎn)生趨化因子，誘導(dǎo)其致炎因子引起組織損害。研究發(fā)現(xiàn)IL-17與HBV感染后的肝臟炎性損傷有著密切關(guān)系，大部分CHB患者IL-17水平與ALT和病毒載量呈正相關(guān)［8］。IL-10是一種強(qiáng)有力的免疫和炎癥抑制因子，它可以抑制Th1型免疫應(yīng)答，降低CHB患者的細(xì)胞免疫功能，促進(jìn)Treg的增殖和活化，導(dǎo)致HBV持續(xù)存在［9］。Arnaud等研究表明CHB患者IL-10水平明顯升高，高水平的IL-10不利于HBV的清除［10］。如何最大程度改善CHB患者感染后免疫耐受狀態(tài)，恢復(fù)T淋巴細(xì)胞亞群的平衡，改善細(xì)胞因子的失調(diào)，徹底清除HBV，是治療HBeAg陰性CHB的關(guān)鍵。

恩替卡韋是目前治療HBeAg陰性CHB抗病毒極有前景的藥物，能強(qiáng)效抗病毒，且耐藥率低。中醫(yī)藥對(duì)HBV的直接作用不及現(xiàn)在的西藥抗病毒藥物，但中醫(yī)藥能有效改善CHB患者的宿主狀態(tài)，增強(qiáng)西藥抗病毒效果，阻止或延緩CHB病程進(jìn)一步發(fā)展［11］。地五養(yǎng)肝方通過(guò)補(bǔ)腎來(lái)糾正CHB患者紊亂的免疫功能狀態(tài)，促進(jìn)病毒的清除及肝細(xì)胞的正常再生，方中重用熟地黃補(bǔ)腎填精扶正，茵陳蒿清熱利濕祛邪，共為君藥；五味子配熟地黃增強(qiáng)補(bǔ)腎功能，生甘草配茵陳蒿增強(qiáng)清熱解毒功能，共為臣藥；姜黃辛溫通絡(luò)、活血化瘀為佐藥；方中甘草又能調(diào)和諸藥，行使藥之能。全方共奏補(bǔ)腎祛邪之功。臨床研究表明地五養(yǎng)肝方能改善HBeAg陰性CHB患者臨床證候、抗肝損傷、抗肝纖維化。方中熟地及五味子并入肝腎二經(jīng)，肝腎同養(yǎng)，對(duì)免疫系統(tǒng)具有雙向調(diào)節(jié)作用，使機(jī)體免疫抑制狀態(tài)有一定恢復(fù)［12-13］。

本研究結(jié)果說(shuō)明恩替卡韋抗病毒療效明顯，且可間接改善機(jī)體細(xì)胞免疫功能，與報(bào)道一致［14-15］。地五養(yǎng)肝方能改善HBeAg陰性CHB患者的免疫狀態(tài)，提高恩替卡韋的療效。

綜上所述，T淋巴細(xì)胞及各種細(xì)胞因子在HBeAg陰性CHB的發(fā)病及轉(zhuǎn)歸中起到非常重要的作用，地五養(yǎng)肝方與恩替卡韋聯(lián)用有一定的協(xié)同作用，能更好調(diào)整細(xì)胞因子水平，調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群的平衡，明顯改善肝功能，顯著提高HBV DNA轉(zhuǎn)陰率，提高CHB抗病毒療效。但由于本研究納入病例少，觀察時(shí)間短，對(duì)地五養(yǎng)肝方聯(lián)合恩替卡韋療程及遠(yuǎn)期療效，以及地五養(yǎng)肝方調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子平衡的進(jìn)一步機(jī)制等，還有待進(jìn)一步研究。

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Effects of Diwu Yanggan Decoction on T lymphocyte Subsets and Cytokines in Peripheral Blood in Pa-tients with HBeAg-negative Chronic Hepatitis B

LUO Junhua，CAO Qiushi. Wuhan General Hospital of PLA Guang-zhou Military Command，Wuhan 430070，China

Objective：To investigate the effects of Diwu Yanggan decoction on T lymphocyte subsets and cytokines in peripheral blood in patients with HBeAg-negative chronic hepatitis B.Methods：103 cases with HBeAg-negative CHB were randomly divided into 2 groups.The control group was only given entecavir 0.5 mg/d while the treatment group was added with Diwu Yangganfang on the basis of entecavir.The treatment course was 48 weeks.The variations of HBV DNA，IL-17，IL-10，CD3+，CD4+and CD8+T lymphocytes in the patients were detected.Results：After 48 weeks treatment，Compared with the control group，the negative conversation rate of HBV DNA was significantly higher in the treatment group（P＜0.05）.The percentages of CD4+and CD4+/CD8+T lymphocytes in the treatment group were significantly higher than those in the control group（P＜0.05）.The levels of IL-17 and IL-10 in the treatment group were significantly lower than those in the control group（P＜0.05）. Conclusion：T lymphocyte and cytokines play extremely important role in the onset and transformation of HBeAg-negative chronic hepatitis B.Diwu Yanggan decoction combined with entecavir can significantly increase the percentages of CD4+and CD4+/CD8+T lymphocytes and reduce the levels of IL-17 and IL-10 to improve efficacy.

Diwu Yanggan decoction；Chronic hepatitis B；HBeAg；T lymphocyte subsets；Cytokines

R512.6+2

A

1004-745X（2014）08-1505-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.08.045

2014-04-04）

國(guó)家中醫(yī)藥管理局國(guó)家中醫(yī)臨床研究基地業(yè)務(wù)建設(shè)科研專項(xiàng)課題（JDZX2012052）