人參皂苷Rh2通過GATA-1誘導(dǎo)K562細(xì)胞紅系分化作用的研究*

武 劍 王 煒 李 曉

（浙江省杭州市第一人民醫(yī)院，浙江 杭州 310006）

人參皂苷Rh2通過GATA-1誘導(dǎo)K562細(xì)胞紅系分化作用的研究*

武 劍 王 煒 李 曉

（浙江省杭州市第一人民醫(yī)院，浙江 杭州 310006）

目的了解人參皂苷Rh2是否通過GATA-1蛋白誘導(dǎo)白血病細(xì)胞株K562的分化作用。方法利用凝膠集落生成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度人參皂苷Rh2對(duì)白血病細(xì)胞株K562的增殖抑制作用；采用免疫細(xì)胞化學(xué)法和Western-blot法檢測(cè)不同濃度人參皂苷Rh2處理前后K562細(xì)胞株中GATA-1蛋白表達(dá)情況。結(jié)果凝膠集落生成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示人參皂苷Rh2對(duì)K562細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用，且呈劑量依賴性；免疫細(xì)胞化學(xué)法和Western-blot法提示人參皂苷Rh2可誘導(dǎo)K562細(xì)胞內(nèi)GATA-1表達(dá)，且呈劑量依賴性。結(jié)論人參皂苷Rh2可顯著抑制白血病細(xì)胞株K562的生長(zhǎng)，其作用呈濃度依賴性；人參皂苷Rh2在體外可通過上調(diào)GATA-1蛋白表達(dá)誘導(dǎo)K562向紅系細(xì)胞方向分化。

人參皂苷Rh2 白血病 分化 GATA-1

研究認(rèn)為人參皂苷Rh2可提升人體免疫力，刺激正常人紅系和粒系祖細(xì)胞分化而促進(jìn)血細(xì)胞生成［1］，但目前關(guān)于其機(jī)制的研究尚不十分明確。本課題旨在通過各種檢測(cè)方法，在體外觀察人參皂苷Rh2對(duì)白血病細(xì)胞株K562的紅系分化作用并初探其機(jī)制，從而為人參皂苷Rh2臨床使用提供更有利證據(jù)，也為白血病治療尋找新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 K562細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存，IMDM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，小牛血清購(gòu)自杭州四季青公司，GATA-1抗體、二抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，β-actin抗體購(gòu)自武漢博士德公司，人參皂苷Rh2購(gòu)自浙江亞克藥業(yè)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將K562細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含15％小牛血清的IMDM培養(yǎng)基中，置于37℃，5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 集落生成實(shí)驗(yàn) 計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度為5×103/mL，分為10、20、40和80 mg/L 4個(gè)濃度為實(shí)驗(yàn)組，并以不加藥為對(duì)照組，共5組分別進(jìn)行細(xì)胞集落培養(yǎng)，做3個(gè)重復(fù)孔并重復(fù)3遍。于37℃、5％CO2的恒溫箱中培養(yǎng)7 d后，以大于40個(gè)細(xì)胞的聚合為一個(gè)集落，觀察計(jì)數(shù)每孔的集落數(shù)，并計(jì)算抑制率/％=（A對(duì)照組－A實(shí)驗(yàn)組）/A對(duì)照組×100％。

1.4 細(xì)胞免疫化學(xué) 5組細(xì)胞于恒溫箱中培養(yǎng)7 d后，收集細(xì)胞并調(diào)整濃度為1×106/mL取100 μL，800 rpm離心5 min甩片。4％多聚甲醛固定15 min，PBS清洗標(biāo)本3次，0.5％Triton X-100（DPBS配）孵育20 min，PBS清洗標(biāo)本3次。GATA-1一抗孵育4℃過夜，用PBS液清洗標(biāo)本3次，二抗37℃孵育30 min，PBS清洗標(biāo)本3次各5min，DAB顯色，蒸餾水洗2次，蘇木素復(fù)染1min，自來水洗30 min，中性樹膠封片。

1.5 Western-blot法檢測(cè)K562細(xì)胞內(nèi)GATA-1蛋白表達(dá)量 5組細(xì)胞于恒溫箱中培養(yǎng)7d后，收集細(xì)胞并分別提取蛋白，Western-blot法檢測(cè)各組GATA-1蛋白表達(dá)情況，以β-actin為內(nèi)參。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)處理。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷Rh2對(duì)K562細(xì)胞半固體集落生成的影響 見表1。使用不同劑量人參皂苷Rh2處理K562細(xì)胞7 d后，隨著劑量的增加，人參皂苷Rh2對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率升高，呈一定的劑量依賴關(guān)系。

表1 人參皂苷Rh2對(duì)K562細(xì)胞集落生成的抑制（n＝9，±s）

表1 人參皂苷Rh2對(duì)K562細(xì)胞集落生成的抑制（n＝9，±s）

與對(duì)照組比較，△P＜0.05。

組 別 人參皂苷Rh2（mg/L）集落數(shù)/103個(gè)細(xì)胞 抑制率（％）對(duì)照組 0141.0±4.3 0實(shí)驗(yàn)組1 10127.1±4.6△ 9.8±3.3△實(shí)驗(yàn)組2 20112.8±4.0△ 20.0±3.5△實(shí)驗(yàn)組3 4071.9±4.8△ 48.9±4.2△實(shí)驗(yàn)組4 8052.3±4.2△ 62.9±3.2△

2.2 人參皂苷Rh2對(duì)K562細(xì)胞中GATA-1蛋白表達(dá)的影響 見圖1，圖2。不同濃度人參皂苷Rh2處理K562細(xì)胞7d后，隨著劑量的增加，細(xì)胞免疫化學(xué)及Western-blot法檢測(cè)均顯示人參皂苷 Rh2可誘導(dǎo)K562細(xì)胞GATA-1蛋白表達(dá)的增高，且呈一定劑量依賴性。

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為白血病是由于“邪毒”侵入營(yíng)血，攻注骨髓、肝、腎，從而使陰陽(yáng)失衡，骨髓造血功能障礙而發(fā)?。?］。中醫(yī)對(duì)白血病的治療主要是調(diào)理陰陽(yáng)，使肝、脾、腎等器官功能得到恢復(fù)，同時(shí)可促進(jìn)幼稚細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)其分化等作用，使骨髓造血功能重新啟動(dòng)，以達(dá)到陰陽(yáng)平衡，使白血病患者達(dá)到康復(fù)。人參作為抗衰老、強(qiáng)壯劑和補(bǔ)氣血藥物已有千余年的應(yīng)用歷史，有關(guān)人參皂苷可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究已成為近年來國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)［3-4］。

人白血病細(xì)胞株K562是急性髓系白血病細(xì)胞，在誘導(dǎo)因素作用下可向多系分化，它與人多向造血祖細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn)相似，是研究細(xì)胞分化的理想模型。本實(shí)驗(yàn)以K562細(xì)胞株為研究對(duì)象，觀察人參皂苷Rh2對(duì)K562細(xì)胞的增殖抑制及誘導(dǎo)分化作用，并初步探索其機(jī)制。結(jié)果顯示人參皂苷Rh2對(duì)K562細(xì)胞的增殖抑制作用具有劑量依賴性，隨著劑量的增加，抑制作用增強(qiáng)。在誘導(dǎo)紅系分化方面，添加不同劑量的人參皂苷Rh2可明顯提高K562細(xì)胞紅系特異性核轉(zhuǎn)錄因子GATA-1蛋白的表達(dá)，提示人參皂苷Rh2可能具有誘導(dǎo)紅系分化的作用，從而為人參皂苷Rh2今后的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

圖1 細(xì)胞免疫化學(xué)法檢測(cè)人參皂苷Rh2對(duì)K562細(xì)胞中GATA-1蛋白表達(dá)的作用（×1000）

圖2 蛋白免疫印跡法檢測(cè)人參皂苷Rh2對(duì)K562細(xì)胞中GATA-1表達(dá)

［1］姚云，陳雪松，趙英佒，等.人參皂苷Rh2調(diào)節(jié)白血病細(xì)胞增殖分化的作用［J］.解剖學(xué)雜志，2011，34（4）：469-472.

［2］何南，姚晶，潘小濤，等.白血病的中藥治療［J］.吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，32（3）：171-173.

［3］黃莉，黃純蘭.威靈仙總皂苷誘導(dǎo)急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株NB4分化作用的研究［J］.中國(guó)中醫(yī)急癥，2012，21（8）：1248-1250.

［4］Yi JS，Choo HJ，Cho BR，et al.Ginsenoside Rh2 induces ligand-independent Fas activation via lipid raft disruption［J］. Biochem Biophy Res Comm，2009，385（2）：154-159.

Effect of Ginsenoside Rh2 on Inducing Erythroid Differentiation of K562 Cells through GATA-1

WU Jian，WANG Wei，LI Xiao.Hangzhou First People's Hospital，Zhejiang，Hangzhou 310006，China

Objective：To investigate whether the ginsenoside Rh2 could induce the differentiation of K562 cells through GATA-1.Methods：K562 cells were treated with different concentrations of ginsenoside Rh2.Gel colony forming experiment was used to detect the proliferation.Immunocytochemical and Western-blot were used to detect the expression of GATA-1 in K562 cells.Results：Ginsenoside Rh2 could significantly inhibit proliferation and enhance expression of GATA-1 in K562.Conclusion：Ginsenoside Rh2 can significantly inhibit the growth of K562 and induce its erythroid differentiations.

Ginsenoside Rh2；Leukemia；Differentiation；GATA-1

R285.5

A

1004-745X（2014）08-1451-02

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.08.021

2014-04-23）

浙江省杭州市醫(yī)藥衛(wèi)生計(jì)劃項(xiàng)目（2012B005）