GSH對MRL/1pr小鼠腎小管上皮細胞CTGF表達的影響研究

劉樹鋒 張北平 王 海 譚 校

（汕頭大學醫(yī)學院附屬粵北人民醫(yī)院風濕免疫科，廣東 韶關(guān) 512026）

GSH對MRL/1pr小鼠腎小管上皮細胞CTGF表達的影響研究

劉樹鋒 張北平 王 海 譚 校

（汕頭大學醫(yī)學院附屬粵北人民醫(yī)院風濕免疫科，廣東 韶關(guān) 512026）

目的 研究還原型谷胱甘肽（GSH）對MRL/lpr小鼠（狼瘡小鼠）腎小管上皮細胞結(jié)締組織生長因子（CTGF）的表達，明確抗氧化藥GSH對腎小管上皮細胞表達CTGF的影響。方法 傳代培養(yǎng)正常小鼠及狼瘡小鼠腎小管上皮細胞至第3代，使用GSH干預(yù)生長MRL/lpr小鼠腎小管上皮細胞，培養(yǎng)5 d后檢測CTGF蛋白及mRNA的表達。結(jié)果 狼瘡小鼠腎小管上皮細胞內(nèi)CTGF表達明顯高于正常對照組（P＜0.01）。經(jīng)GSH干預(yù)后MRL/lpr小鼠模型腎小管上皮細胞CTGFmRNA表達較未處理組顯著降低（P＜0.01）。結(jié)論 狼瘡小鼠腎小管上皮細胞內(nèi)CTGF表達明顯升高，抗氧化劑GSH干預(yù)可抑制狼瘡小鼠腎小管上皮細胞CTGF表達。

還原性谷胱甘肽；腎小管上皮細胞；結(jié)締組織生長因子

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是一種常見自身免疫性疾病，幾乎所有患者都有腎臟病理損害，在狼瘡性腎炎（LN）發(fā)病機制中，沉積的免疫復(fù)合物介導的炎性細胞釋放出大量的超氧陰離子以及活性氧簇（ROS），并且能合成和釋放轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、CTGF等活性細胞因子，可造成腎臟的形態(tài)學和功能改變，促進腎間質(zhì)成分纖維化增生。這一系列改變與腎組織抗氧化能力降低密切相關(guān)[1]。GSH是抗氧化防御系統(tǒng)中的最主要成分，在機體的抗氧化損傷中發(fā)揮重要作用[2]，SLE患者血清中GSH降低，加重LN中的氧化損害，而一定水平的GSH在LN的抗氧化保護中起到重要作用[3]。CTGF已經(jīng)被證實與LN間質(zhì)纖維化有明顯相關(guān)性，LN中氧化損害可致CTGF表達增多，腎組織纖維化發(fā)展。本研究通過研究狼瘡小鼠腎小管上皮細胞中CTGF的表達，并進一步研究抗氧化劑GSH對狼瘡小鼠腎小管上皮細胞中CTGF的表達影響，探討GSH抗氧化作用在LN間質(zhì)纖維化中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象：正常對照組：SPF級C57BL/6雌性小鼠；LN模型組：SPF級MRL/1pr雌性小鼠，各6只。

1.2 試劑及儀器：Trizol Reagent（Invitrogen公司），PrimeScript RTPCR試劑盒（寶生物工程有限公司），2×EasyTaqPCRSuperMix試劑盒（全式金生物技術(shù)有限公司），PCR引物合成（瑞真生物技術(shù)有限公司），T Gradient PCR儀（Biometra公司），胎牛血清（GIBCO），CTGF酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒（瑞齊生物公司），還原型谷胱甘肽（重慶藥友制藥有限責任公司）。

1.3 取16周齡SPF級MRL/1pr雌性小鼠及C57BL/6 雌性小鼠各6只，斷頸法處死。分別于無菌環(huán)境下分離腎小管節(jié)段，采用胰蛋白酶消化各于六孔板細胞培養(yǎng)板傳代培養(yǎng)腎小管上皮細胞，穩(wěn)定培養(yǎng)至第3代，分3個實驗為組，每組6個樣本處理如下：①正常對照組腎小管上皮細胞（NS 0.9%干預(yù)）②狼瘡小鼠腎小管上皮細胞（NS 0.9%干預(yù)）③狼瘡小鼠腎小管上皮細胞（GSH 0.5mg/ml干預(yù)組）。

1.4 細胞培養(yǎng)至第5天，用Trizol Reagent分別提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA用熒光定量PCR方法檢測CTGF的mRNA水平（各步驟均按照試劑盒說明操作）。3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參照；上海英駿生物技術(shù)有限公司合成引物：GAPDH （150bp）上游：TGTGTCCGTCGTGGATCTGA，下游：TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG；CTGF（112bp）上游: GTGTGTGACGAGCCCAAGGA，下游: AGTTGGGTCTGGGCCAAATGT，反應(yīng)條件95 ℃ 5min→94 ℃ 10s→59 ℃，45個循環(huán)。重復(fù)3次獨立的RT-PCR全過程。以倍比稀釋的cDNA為模板制作標準曲線，R2＞0.98。經(jīng)細胞裂解液裂解細胞，酶聯(lián)免疫吸附法檢測CTGF蛋白濃度。

2 實驗結(jié)果

2.1 統(tǒng)計學處理

用SPSS15.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（）表示，兩樣本比較用t檢驗。P＜0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

2.2 CTGF的表達檢測結(jié)果

見表1。

表1 CTGF的表達檢測結(jié)果

3 結(jié) 論

狼瘡小鼠腎小管上皮細胞內(nèi)CTGF mRNA及蛋白表達均明顯高于正常對照（P＜0.01），經(jīng)GSH干預(yù)培養(yǎng)后，狼瘡小鼠腎小管上皮細胞內(nèi)CTGF mRNA及蛋白表達均降低（P＜0.01）。

4 討 論

在對終末期腎病腎小管間質(zhì)病變中，已經(jīng)證實免疫性炎癥聯(lián)合氧化損害可以引起TGF-β1合成和分泌，刺激腎小管上皮細胞分泌CTGF，CTGF作用于間質(zhì)細胞及腎小管上皮細胞，促使膠原合成和細胞外基質(zhì)的堆積、成肌纖維細胞的形成，使腎間質(zhì)纖維化發(fā)展。既往研究證實，在LN病理中，炎癥損害導致活性氧分子大量產(chǎn)生，致使抗氧化防御穩(wěn)態(tài)失衡；同時機體內(nèi)最重要的抗氧化因子GSH水平下降[4]，導致腎小管上皮細胞CTGF合成增加，加速腎間質(zhì)纖維化發(fā)展。本研究證實，在狼瘡小鼠腎小管上皮細胞中，CTGF表達高于正常對照組，國內(nèi)也有研究發(fā)現(xiàn)正常腎組織沒有或只有極少量CTGFmRNA 轉(zhuǎn)錄和蛋白表達[5]，LN患者腎組織CTGF表達量顯著增加，并與腎小管間質(zhì)病變程度成正比[6]，進一步說明在狼瘡小鼠腎小管上皮細胞中CTGF的高度表達，參與介導了腎間質(zhì)纖維化改變。

既往研究證實，在狼瘡患者脂質(zhì)過氧化與腎臟和動脈病變存在統(tǒng)計學關(guān)聯(lián)[7]，LN患者體內(nèi)普遍存在氧化應(yīng)激，與免疫性炎癥一起參與腎病的發(fā)病與病程進展，機體內(nèi)抗氧化功能相對或絕對的降低，出現(xiàn)氧化/抗氧化失平衡，導致腎組織氧化損害。GSH是抗氧化防御系統(tǒng)中的最主要成分，可以直接對抗活性氧自由基，減少氧自由基對腎組織的損傷作用。目前研究證實：在SLE患者體內(nèi)GSH水平明顯降低[8]。在本研究中，經(jīng)過GSH干預(yù)培養(yǎng)的腎小管上皮細胞內(nèi)CTGF表達明顯降低，說明GSH可能通過改善細胞氧化應(yīng)激狀態(tài)降低CTGF的表達，從而對其介導的膠原增生有一定的阻斷作用。這種阻斷效應(yīng)可用于改善狼瘡性腎病的長期預(yù)后，減緩間質(zhì)纖維化進程，保護殘存腎單位功能。目前在多種腎病的臨床治療過程中已經(jīng)使用GSH抗氧化損害，對于腎功能及預(yù)后有所改善[9-10]，進一步的研究需要監(jiān)測經(jīng)過GSH治療的SLE患者腎組織CTGF以及纖維化程度，評估其對腎間質(zhì)纖維化的治療效果，可能為探索抗纖維化治療提供的更多依據(jù)。

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R593.24+1

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1671-8194（2014）19-0113-02