藥品微生物限度檢查用培養(yǎng)基儲存期限的探討

陳曉燕

（浙江省玉環(huán)縣食品藥品檢驗檢測中心，浙江 玉環(huán) 317605）

藥品微生物限度檢查用培養(yǎng)基儲存期限的探討

陳曉燕

（浙江省玉環(huán)縣食品藥品檢驗檢測中心，浙江 玉環(huán) 317605）

目的 對藥品微生物限度檢查用培養(yǎng)基的儲存期限問題進(jìn)行研究，通過實驗確定最優(yōu)存儲方法和時限。方法 分別將現(xiàn)配培養(yǎng)基為對照與2～8 ℃避光冷藏15、30、60 d的培養(yǎng)基進(jìn)行微生物限度適用性檢查，用標(biāo)準(zhǔn)菌株在各培養(yǎng)基中生長情況通過回收率及指示能力確定在此環(huán)境中保存配制好經(jīng)滅菌的培養(yǎng)基的適用性符合藥典相關(guān)規(guī)定。結(jié)果 各標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌于各培養(yǎng)基在促生長能力檢查時的回收率均＞70%，及各培養(yǎng)基對相應(yīng)試驗菌的指示能力均符合規(guī)定。結(jié)論 配制好經(jīng)滅菌的培養(yǎng)基在2～8 ℃避光冷藏60 d可以達(dá)到要求。

藥品微生物限度檢查；培養(yǎng)基；保存；回收率

2010版《藥典》附錄ⅩⅢ C微生物限度檢查法未對適用培養(yǎng)基的儲存條件及期限進(jìn)行規(guī)定。為保證實驗質(zhì)量，本文通過實驗研究對配制好用硅膠塞及牛皮紙捆綁包裹瓶口經(jīng)滅菌的培養(yǎng)基在溫度為2～8 ℃避光儲藏，分別于15、30、60 d進(jìn)行適用性檢查，已確保微生物限度檢查結(jié)果的可靠。

1 材料設(shè)備

1.1 儀器設(shè)備：恒溫干燥箱；凈化工作臺；生化培養(yǎng)箱；立式壓力蒸汽滅菌器；霉菌培養(yǎng)箱。

1.2 菌種：大腸埃希菌［CMCC（B）44102］；金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］；枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］；白色念珠菌［CMCC（F）98001］；乙型副傷寒沙門菌［CMCC（B）50094］；黑曲霉菌［CMCC（F）98003］。以上均從廣東省微生物研究所菌種保藏中心購得的冷凍干燥菌種，按規(guī)定復(fù)蘇、傳代、保藏和使用，試驗用菌株的傳代次數(shù)均未超過5代。

1.3 培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基；甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基；溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基；麥康凱培養(yǎng)基。以上培養(yǎng)基均由環(huán)凱生物制品有限公司購進(jìn)，均在有效期內(nèi)按成品培養(yǎng)基說明配置使用。

2 方法和結(jié)果

2.1 實驗環(huán)境

在環(huán)境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣超凈臺中操作。

2.2 菌液制備

2.2.1 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，33 ℃培養(yǎng)24 h，用0.9%的無菌氯化鈉溶液，10倍遞增稀釋成每1 mL含菌數(shù)為50～100 cfu的菌懸液，室溫放置下2 h內(nèi)使用。

2.2.2 接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，27 ℃培養(yǎng)48 h，用0.9%的無菌氯化鈉溶液，10倍遞增稀釋成每1 mL含菌數(shù)為50～100 cfu的菌懸液，室溫放置下2 h內(nèi)使用。

2.2.3 接種黑曲霉菌新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，27 ℃培養(yǎng)7 d，加入5 mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，然后用開口帶有薄的無菌棉花能過濾菌絲的無菌毛細(xì)吸管，吸出孢子懸液質(zhì)無菌試管內(nèi)，用0.9%的無菌氯化鈉溶液，10倍遞增稀釋成每1 mL含菌數(shù)為50～100 cfu的菌懸液，2～8 ℃放置下，24 h內(nèi)使用。

2.3 培養(yǎng)基配置

取各類培養(yǎng)基按要求用500 mL三角燒瓶各配制200 mL，用硅膠塞及牛皮紙捆綁包裹瓶口滅菌備用作為對照培養(yǎng)基。另取上述培養(yǎng)基按要求用500 mL三角燒瓶各配制200 mL，用硅膠塞及牛皮紙捆綁包裹瓶口后置于2～8 ℃避光冷藏15、30、60 d。

2.4 試驗方法和結(jié)果

分別將現(xiàn)配對照培養(yǎng)基與2～8 ℃避光冷藏15、30、60 d的培養(yǎng)基進(jìn)行適用性檢查（促生長能力和抑制能力；指示能力），每個培養(yǎng)基進(jìn)行3次獨(dú)立的平行實驗，所得菌落數(shù)為3次獨(dú)立平行實驗的平均數(shù)。

2.4.1 取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌混懸液各2 mL分別放于6個平皿中，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻，同時做空白對照，置30～35 ℃培養(yǎng)48 h，計數(shù)。結(jié)果見表1。

表1 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基適用性檢查

2.4.2 取白色念珠菌、黑曲霉菌的菌懸液-各2 mL分別放入4個平皿中每種菌懸液各2皿，每皿各1 mL），加入玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基各20 mL，混勻，同時做一空白試驗。27 ℃培養(yǎng)72 h，計數(shù)。結(jié)果見表2。

表2 玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基適用性檢查

2.4.3 取乙型副傷寒沙門菌的菌懸液各0.2 mL，分別涂布接種與2個已預(yù)培養(yǎng)8 h后并無菌生長的麥康凱瓊脂培養(yǎng)基中，混勻。同時，做一空白試驗。33 ℃培養(yǎng)18 h，計數(shù)（空白試驗培養(yǎng)48 h觀察結(jié)果）。結(jié)果見表3。

表3 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基適用性檢查

2.4.4 取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌的菌懸液各0.2 mL，分別涂布接種與已預(yù)培養(yǎng)8 h后并無菌生長的甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基各2皿中，混勻。同時，做一空白試驗。33 ℃培養(yǎng)24 h，計數(shù)（空白試驗和接種大腸埃希菌平皿的試驗培養(yǎng)72 h觀察結(jié)果）。結(jié)果見表4。

表4 甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基適用性檢查

2.4.5 取大腸埃希菌、銅綠假單胞菌的菌懸液各0.3 mL，分別涂布接種與已預(yù)培養(yǎng)8 h后并無菌生長的十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基各3皿中，混勻。同時，做一空白試驗35 ℃培養(yǎng)18 h，計數(shù)（空白試驗和接種大腸埃希菌平皿的試驗培養(yǎng)72 h觀察結(jié)果）。結(jié)果見表5。

表5 十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基適用性檢查

2.4.6 指示能力試驗：取試驗菌0.1 mL，分別涂布于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基上，在相應(yīng)的控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度和時間下培養(yǎng)，結(jié)果被檢培養(yǎng)基上試驗菌的菌落形態(tài)，菌落顏色及指示反應(yīng)情況與對照培養(yǎng)基一致。各試驗菌在相應(yīng)的培養(yǎng)基上的形態(tài)，顏色均與在對照培養(yǎng)基上抑制。

3 結(jié) 論

在《食品微生物學(xué)檢驗 培養(yǎng)基和試劑質(zhì)量要求》通常建議實驗室自制培養(yǎng)基在保證其成分不會改變條件下保存，即避光、干燥保存，必要時在（5±3） ℃冰箱中保存，瓶裝及試管裝培養(yǎng)基不超過3～6個月[5]。而《藥典》附錄XⅢ2010版對微生物限度檢查的瓶裝培養(yǎng)基未明確進(jìn)行規(guī)定和建議。本文通過實驗表明，接種大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌于各培養(yǎng)基在促生長能力檢查時的回收率均＞70%，及各培養(yǎng)基對相應(yīng)試驗菌的指示能力均符合規(guī)定，空白對照無菌生長。可知，本實驗室配制經(jīng)滅菌后培養(yǎng)基的儲存時限可采用在2～8 ℃冷藏保存期限為60 d，其結(jié)果符合藥典相關(guān)規(guī)定。日常工作中保證了微生物限度檢查結(jié)果的可靠、有效。

[1] 國家藥典委員會中華人民共和國藥典.附錄XⅢ[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010.

[2] 中國藥品生物制品檢定所中國藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010.

[3] 蘇德模,馬緒榮.藥品微生物學(xué)檢驗技術(shù)[M].北京:華齡出版社, 2007.

[4] 藥品GMP指南[M].北京:.中國醫(yī)藥科技出版社,2010.

[5] GB.4789.28-2013.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)、微生物學(xué)檢驗、培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2013.

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1671-8194（2014）19-0111-02