IPAF和NALP1在RA滑膜中表達(dá)及其意義的探討

梁 晶 潘云峰* 宋澤蓉 郭 欣 郭興華

（廣州市花都區(qū)人民醫(yī)院風(fēng)濕科，廣東 廣州 510800）

IPAF和NALP1在RA滑膜中表達(dá)及其意義的探討

梁 晶 潘云峰* 宋澤蓉 郭 欣 郭興華

（廣州市花都區(qū)人民醫(yī)院風(fēng)濕科，廣東 廣州 510800）

目的 通過檢測并比較類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎及關(guān)節(jié)創(chuàng)傷者組滑膜中IPAF1的表達(dá)，探討IPAF和NALP1在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜中的意義。方法 免疫組化檢測滑膜襯里層IPAF 和NALP1蛋白質(zhì)表達(dá)，于顯微鏡下觀察，隨機選取4個視野，連續(xù)計數(shù)100個位于滑膜襯里層的細(xì)胞及其中的陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值，計算陽性細(xì)胞率，間接比較蛋白表達(dá)。結(jié)果 滑膜組織免疫組化結(jié)果顯示：RA組IPAF蛋白表達(dá)陽性率大于OA和Trauma組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；NALP1僅在RA組表達(dá)，OA和Trauma組未見表達(dá)。結(jié)論 IPAF和NALP1在RA滑膜組織中有豐富表達(dá)，且其表達(dá)水平明顯高于OA及Trauma組，提示IPAF和NALP1可能參與RA的慢性滑膜炎癥過程。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；滑膜；IPAF；NALP1

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種侵犯全身多關(guān)節(jié)的系統(tǒng)性疾病，主要以關(guān)節(jié)滑膜受累，滑膜炎性細(xì)胞浸潤及襯里層增生是其典型病理改變。RA滑膜中的成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞（fibroblast-like synoviocyte，F(xiàn)LS）發(fā)生了腫瘤樣變，表現(xiàn)出逃脫免疫抑制，侵襲性，分泌細(xì)胞因子的特性，這些細(xì)胞因子是否在RA-FLS生物學(xué)特性改變中起作用及如何起作用尚不明確。眾所周知，IL-1β在RA病情進展及局部炎癥中發(fā)揮著重要作用，表現(xiàn)為：IL-1β是重要的軟骨破壞因子，并抑制膠原蛋白合成，阻止關(guān)節(jié)破壞的修復(fù)；放大激活T細(xì)胞和B細(xì)胞，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，促進破骨溶骨等。而IPAF[the IL1B-converting enzyme （ICE）-protease activating factor]和NALP [NOD and the NTPases implicated in apoptosis and multihistocompatability complex transcription （NACHT）leucine-rich repeat protein]1是炎性復(fù)合體（inflammasome）的重要組份，它們與inflammasome的其他組份共同作用，加工某些炎性因子前體，使之成為有活性的炎性因子如IL-1β，從而參與多種自身免疫病的炎性反應(yīng)。可見炎性復(fù)合體是IL-1β合成所必不可少的一種物質(zhì)。由于RA、IL-1β及炎性復(fù)合體三者間的關(guān)系，我們有理由相信，IPAF和NALP1對RA炎癥有一定貢獻。本實驗擬研究RA滑膜是否表達(dá)IPAF和NALP1及該表達(dá)對RA炎癥有何意義。

1 材料與方法

1.1 材料

濃縮型DAB試劑盒（廣州中杉金橋公司）；兔抗人IPAF多克隆抗體（美國Novus Biologicals公司）；小鼠抗人NALP1多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；羊抗兔IgG、兔抗鼠IgG（southern biotech公司）；PBS粉（歐蒙（杭州）醫(yī)學(xué)實驗診斷有限公司）；EDTA、免疫組化筆（廣州中杉金橋）；二甲苯，無水乙醇，95%乙醇，75%乙醇，30%過氧化氫，Triton×100，蘇木素，中性樹膠。

1.2 實驗方法

免疫組化染色法：常規(guī)脫蠟、水化后，高壓修復(fù)抗原，依次一抗4 ℃孵育過夜，二抗37 ℃孵育1 h，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水并透明，最后封片鏡檢。用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照，已知陽性的扁桃體切片作為陽性對照，實驗步驟按試劑盒說明進行。

1.2.1 研究對象：滑膜組織來源為2008年4月至2011年5月中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院行關(guān)節(jié)手術(shù)的膝關(guān)節(jié)。關(guān)節(jié)創(chuàng)傷（Trauma）患者3例，其中男∶女=3∶0，年齡39～46歲，病程5個月～3年。骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）患者4例，男∶女=1∶3，年齡45～73歲，病程3～13年。RA患者6例，男∶女=0∶6，年齡45～59歲，病程5～9年。所有RA患者診斷符合1987 年美國風(fēng)濕病學(xué)會（american college of rheumatology，ACR）類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎分類標(biāo)準(zhǔn)。所有OA患者診斷符合1986年美國風(fēng)濕病學(xué)會（american college of rheumatology，ACR）骨關(guān)節(jié)炎分類標(biāo)準(zhǔn)。正常對照組取自關(guān)節(jié)創(chuàng)傷患者，符合：術(shù)中僅見創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎性改變或無改變，排除RA、OA及其他關(guān)節(jié)病變診斷。免疫組化陽性對照標(biāo)本為扁桃體炎患者行扁桃體摘除術(shù)所得的扁桃體組織。

1.2.2 標(biāo)本采集和保存：標(biāo)本離體后經(jīng)10%中性福爾馬林液固定，石蠟包埋，連續(xù)切片3張，分別行常規(guī)HE染色、免疫組化分析。

1.2.3 結(jié)果判斷：根據(jù)HE染色片的結(jié)果區(qū)分標(biāo)本的滑膜襯里層和滑膜下層。以細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性細(xì)胞。于顯微鏡200×視野下觀察，隨機選取4個視野，連續(xù)計數(shù)100個位于滑膜襯里層的細(xì)胞及其中的陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值，計算陽性細(xì)胞百分率。

圖1 免疫組化檢測IPAF在滑膜組織中的表達(dá)（左100×，右200×）：（A 陽性切片（扁桃體組織）；B 陰性切片；C RA；D OA；E Trauma）

圖2 免疫組化檢測NALP1在滑膜組織中的表達(dá)（左100×，右200×）（A 陽性切片（扁桃體組織）；B 陰性切片；C RA；D OA；E Trauma）

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)方法：應(yīng)用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，多組間用多組定量資料的方差分析和比較，兩兩之間的比較用LSD檢驗，檢驗水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié) 果

陽性對照可見扁桃體生發(fā)中心呈明顯胞質(zhì)陽性，如圖1、2中箭頭所示。陰性對照全片未見任何棕黃或棕褐色顆粒。IPAF和NALP1具體陽性率詳見表1和表2。

表1 三組標(biāo)本滑膜襯里層IPAF免疫組化陽性細(xì)胞率（RA組n=6，OA組＝4，Trauma組＝3）

表2 三組標(biāo)本滑膜襯里層NALP1免疫組化陽性細(xì)胞率（RA組n=6，OA組＝4，Trauma組＝3）

2.1 IPAF在滑膜組織中的表達(dá)

鏡下觀察可見IPAF在RA組滑膜襯里層的陽性細(xì)胞率比例高于OA組、Trauma組，見圖1。對IPAF的三組行多組定量資料的方差分析和比較，結(jié)果顯示三組間差別有統(tǒng)計學(xué)意義（F=6.870，P＜0.05）。用LSD法進行兩兩比較，結(jié)果顯示RA與OA、RA與Trauma組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），OA與Trauma間差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。

2.2 NALP1在滑膜組織中的表達(dá)

NALP1僅在RA組有表達(dá)，另兩組為陰性，見圖2。由于NALP1在OA和Trauma組均表達(dá)為陰性，故這三組不進行統(tǒng)計學(xué)分析。

3 討 論

RA關(guān)節(jié)滑膜炎是其基本病理特征，其中以滑膜襯里層增生為著。RA滑膜襯里層由正常的2～3層增厚至10～20層，主要為巨噬細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞（macrophage-like synoviocytes，MLS）和成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞（fibroblast-like synoviocyte，F(xiàn)LS）[1]。MLS表現(xiàn)出高度活性，可產(chǎn)生大量前炎性因子、趨化因子、生長因子，如腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor –alpha，TNF）-α、TGF-β、IL-1和IL-6[2-4]。這些因子能夠激活滑膜襯里層的FLS，并誘導(dǎo)其產(chǎn)生一系列介質(zhì)，使FLS具有獨特的侵襲特性及其能夠合成多種蛋白酶，直接和間接的侵蝕軟骨及骨組織，使之成為軟骨破壞的最主要因素[5]。

IL-1β轉(zhuǎn)化酶蛋白酶激活因子[the IL1B-converting enzyme（ICE）-protease activating factor （IPAF）]和NOD和與細(xì)胞凋亡和組織相容復(fù)合體轉(zhuǎn)錄（NACHT）相關(guān)的富集亮氨酸的NTP蛋白酶[NOD and the NTPases implicated in apoptosis and multihistocompatability complex transcription （NACHT）leucine-rich repeat protein，NALP]1均是NLRs[nucleotide-binding and oligomerisation domain （NOD）-like receptors]家族成員。臨床和實驗研究表明，二者分別作為炎性復(fù)合體（inflammasome）-IPAF inflammasome 和NALP1 inflammasome的重要組份，經(jīng)一系列反應(yīng)，最終促進炎性因子如IL-1β合成，因此，二者在自身反應(yīng)性炎癥和某些炎性風(fēng)濕病的發(fā)病中起到重要作用，如幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎全身發(fā)作（systemic onset juvenile idiopathic arthritis,SOJIA）[6]，成人Still病[7,8]，痛風(fēng)[9-11]和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[12]，但它們在疾病中哪些組織細(xì)胞表達(dá)、具體作用機制如何，目前尚不明確。

研究認(rèn)為，巨噬細(xì)胞和角質(zhì)化細(xì)胞分泌IL-1β有賴于炎性復(fù)合體的參與。NALP1和IPAF是炎性復(fù)合體的重要組分，在正常細(xì)胞內(nèi)環(huán)境下，這兩種蛋白質(zhì)功能受到抑制，處于失活狀態(tài)。NALP1和IPAF的NACHT結(jié)構(gòu)域被LRR域折疊，防止激活。當(dāng)內(nèi)環(huán)境接受PAMP或感受到危險信號時，LRR域誘導(dǎo)構(gòu)象重排，暴露NACHT結(jié)構(gòu)域并發(fā)生寡聚化，招募下游的inflammasome蛋白。隨后經(jīng)ASC介導(dǎo)，caspase激活。最終，活化的caspase使IL-1β等炎性因子前體成熟，參與炎性反應(yīng)。

RA-FLS在病情進展中發(fā)生了類腫瘤樣變化，表現(xiàn)出一些不同于正常FLS的特性，如免疫逃逸，接觸抑制能力消失，自分泌炎性因子。多種炎性因子的合成有賴于IPAF和NALP1的作用，因此，我們推測，RA-FLS可能表達(dá)IPAF和NALP1，它們可能在RA-FLS分泌炎性細(xì)胞因子過程中發(fā)揮重要作用。在本課題中，我們首先對標(biāo)本行HE染色以鑒定滑膜組織，并對滑膜襯里層進行定位，隨后應(yīng)用免疫組化法檢測RA、OA及Trauma三組滑膜組織中滑膜襯里層IPAF和NALP1的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)IPAF高度表達(dá)于RA滑膜襯里層，且水平明顯高于OA組和Trauma組，經(jīng)分析，差別有統(tǒng)計學(xué)意義。NALP1在RA滑膜襯里層有表達(dá)，但在OA、Trauma組中未見表達(dá)。因此，鑒于IPAF及NALP1在炎癥中的特殊地位及我們的實驗結(jié)果，我們有理由相信這二者與RA炎癥有著密切的關(guān)系。該作用發(fā)生于何種細(xì)胞、經(jīng)過何種途徑、有無其他調(diào)節(jié)方式，有待后續(xù)研究?？紤]到滑膜襯里層主要由MLS和FLS二種細(xì)胞組成，免疫組化僅能說明滑膜炎癥與IPAF及NALP1有關(guān)，不能區(qū)分主要通過哪種細(xì)胞作用，下一步實驗將著重研究RA炎癥中占主要作用的FLS與IPAF及NALP1間的關(guān)系。目前已有部分研究成果，我們發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)的RA-FLS中，IPAF和NALP1的表達(dá)水平均高于Trauma組[13]，這進一步驗證了我們的觀點，即IPAF和NALP1可能參與RA的慢性滑膜炎癥過程。

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The Expression and Significance of NALP1 and IPAF of Synovial Obtained from Rheumatoid Arthritis

LIANG Jing, PAN Yun-feng*, SONG Ze-rong, GUO Xin, GUO Xing-hua
(Department of Rheumatology and Immunology, Huadu District People's Hospital, Guangzhou 510800, China)

Objective To investigate the significance of NALP1 and IPAF of synovial obtained from rheumatoid arthritis. Methods Test the NALP1 and IPAF protein expression by immunohistochemical in synovial. Choose 4 perspectives randomly, counter 100 cells in synovial intimal lining and the positive ones continuously, then the positive cell percentage has been calculated from their percentage. Results The expression of IPAF in synovial lining cells of RA samples was significantly higher than that of OA or Trauma(P＜0.05). NALP1 was expressed in RA samples only, while no expression in OA and Trauma samples(P＜0.05). Conclusion RA synovial tissue highly expresses IPAF and NALP1, and the expression of IPAF was significantly higher than that in OA and control，suggesting that IPAF and NALP1 maybe involved in RA chronic synovial inflammation process.

Rheumatoid arthritis; Synovial; IPAF; NALP1

R593.22

B

1671-8194（2014）19-0001-03

廣東省科技廳社會發(fā)展領(lǐng)域科技計劃項目課題（項目編號：1111510400180）

*通訊作者：Email：p-yunfeng@163.com