大腸桿菌碳分解代謝抑制及混合C源共利用的研究進(jìn)展

張 旭，李宜奎，祁慶生

(山東大學(xué) 微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250100)

大腸桿菌利用環(huán)境中的碳水化合物作為生長(zhǎng)代謝的C源和能源時(shí)，需要經(jīng)過(guò)兩層同軸心的外膜和內(nèi)膜(細(xì)胞質(zhì)膜)將其從細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。以大腸桿菌偏好的C源和能源——葡萄糖為例(圖1)，大腸桿菌先通過(guò)位于外膜上的非特異性的OmpC、OmpF和LamB孔蛋白以自由擴(kuò)散的方式將細(xì)胞外的糖分子運(yùn)輸?shù)街苜|(zhì)空間［1］;而后通過(guò)激活內(nèi)膜上特異性的糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)以主動(dòng)運(yùn)輸?shù)姆绞綄⒅苜|(zhì)空間的糖分子運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)。葡萄糖專一性的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)依賴的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTSGlc)是大腸桿菌將周質(zhì)空間內(nèi)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的主要運(yùn)輸途徑［1-3］。PTSGlc由 4 個(gè)蛋白 EI(ptsI)、HPr(ptsH)、EIIAGlc(crr)、EIIBCGlc(ptsG)組成，這些蛋白參與胞內(nèi)PEP與周質(zhì)空間內(nèi)葡萄糖間的磷酸級(jí)聯(lián)傳遞，并同時(shí)將葡萄糖內(nèi)質(zhì)化。可溶性的EI和HPr蛋白是非底物專一性的，是所有磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)中共有組分，負(fù)責(zé)將胞內(nèi)PEP的磷酸基團(tuán)傳遞給糖專一性的可溶性蛋白EIIAGlc和EIIBGlc;糖專一性的膜整合蛋白EIICGlc(和EIIDGlc)負(fù)責(zé)識(shí)別糖分子，并接受EIIBGlc的磷酸，同時(shí)將周質(zhì)空間內(nèi)的糖分子磷酸化和內(nèi)質(zhì)化。其他的糖特異性PTS蛋白，如甘露糖專一性的EIIABMan和EIICDMan，也具有親和轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的能力［1，4］。另外，半乳糖的2種非PTS運(yùn)輸載體GalP和MglBAC同樣具有親和、轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的能力，前者為糖與H+同向運(yùn)輸載體，后者為 ABC(ATP-binding cassette transporter，ABC)運(yùn)輸載體;通過(guò)這2個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)內(nèi)質(zhì)化的葡萄糖需要進(jìn)一步經(jīng)過(guò)Glk(glk)催化并以ATP為磷酸供體將葡萄糖磷酸化為葡萄糖-6-磷酸，以進(jìn)入糖酵解途徑［5］。

PTSGlc不僅是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的主要途徑，而且在細(xì)胞內(nèi)全局信號(hào)調(diào)節(jié)中也起關(guān)鍵作用。當(dāng)環(huán)境中存在葡萄糖和其他C源時(shí)，PTSGlc調(diào)控細(xì)胞優(yōu)先吸收利用葡萄糖，然后再利用其他C源。筆者總結(jié)了葡萄糖存在時(shí)的碳分解代謝抑制作用，并討論了如何通過(guò)代謝工程改造使得大腸桿菌能夠同時(shí)利用多種混合C源。

1 碳分解代謝抑制作用

C源的高效利用對(duì)于微生物在競(jìng)爭(zhēng)的自然環(huán)境下維持生存是十分重要的。為了有效地利用C源，細(xì)菌在不斷的進(jìn)化中獲得了一種自身調(diào)節(jié)機(jī)制，即選擇性優(yōu)先利用能夠供自身快速生長(zhǎng)的C源(如葡萄糖)，抑制次要C源轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝所需酶的合成和激活，這個(gè)現(xiàn)象被定義為碳分解代謝抑制(carbon catabolite repression，CCR)。該機(jī)制導(dǎo)致了C源的先后利用，從而引起細(xì)菌的二次生長(zhǎng)現(xiàn)象。在大腸桿菌中，CCR參與細(xì)胞內(nèi)cAMP(cyclic AMP)、腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase，AC)、代謝激活蛋白(CAP)和 PTSGlc中 EIIAGlc間的信號(hào)調(diào)節(jié)［6］。

其中，對(duì)碳分解代謝抑制影響最大的2個(gè)因素分別是cAMP-cAMP受體蛋白(CRP)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用和誘導(dǎo)物阻遏作用，這2種作用機(jī)制都是以PTSGlc組分中EIIA的磷酸化水平為調(diào)節(jié)信號(hào)。此外，胞質(zhì)中PEP/PYR比率以及一些專一性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子也參與碳分解代謝抑制作用的發(fā)生(圖1)。

圖1 大腸桿菌的PTSGlc參與的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)及碳分解代謝抑制作用Fig.1 Glucose transport system and carbon catabolite repression related with PTSGlcin Escherichia coli

1.1 cAMP-CRP 信號(hào)調(diào)節(jié)

在大腸桿菌中，CAP能夠激活一百多個(gè)啟動(dòng)子的表達(dá)，同時(shí)對(duì)一些基因的轉(zhuǎn)錄起抑制作用［7］。CAP需要先與其變構(gòu)調(diào)節(jié)因子cAMP形成復(fù)合物才能有效地結(jié)合到目標(biāo)基因啟動(dòng)子區(qū)域的操縱序列上，因此CAP的全局信號(hào)調(diào)控取決于胞內(nèi)的cAMP濃度。cAMP是由AC催化生成的，AC的活性又依賴于磷酸化的EIIAGlc(EIIAGlc-P)。除了調(diào)控碳分解代謝相關(guān)基因，CAP還直接參與調(diào)控許多其他胞內(nèi)過(guò)程，如全局調(diào)控因子(FIS)的表達(dá)［8］、三羧酸循環(huán)(TCA)和呼吸作用［9-10］、滲透調(diào)節(jié)［11］、生物膜形成［12］、氮的同化［13］和小的非編碼 RNAs(如 Spot42和 CyaR RNAs)［14］等。

當(dāng)大腸桿菌以葡萄糖或其他PTS糖類為C源生長(zhǎng)時(shí)，胞內(nèi)PEP濃度較高且EIIAGlc大多以非磷酸化狀態(tài)存在，降低培養(yǎng)基中葡萄糖濃度可以使EIIAGlc磷酸化程度提高，而EIIAGlc-P與AC的羧基區(qū)域結(jié)合并激活A(yù)C的酶活性［15-16］。AC的激活使得胞內(nèi) cAMP水平提高，cAMP與其受體蛋白(cAMP receptor protein，CRP)結(jié)合形成 cAMP-CRP復(fù)合物，并激活許多分解代謝相關(guān)的基因和操縱子(如乳糖、蜜二糖、甘油和麥芽糖等的分解代謝)。也就是說(shuō)，優(yōu)勢(shì)C源存在降低了細(xì)胞內(nèi)的cAMPCRP水平，使得次級(jí)C源的利用能力降低從而起到抑制作用。Inada 等［17］和 Deutscher等［18］認(rèn)為cAMP-CRP介導(dǎo)的分解代謝基因的調(diào)控主要是在生長(zhǎng)延遲期發(fā)揮作用，而后的CCR是由誘導(dǎo)物阻遏調(diào)節(jié)的。

1.2 誘導(dǎo)物阻遏

誘導(dǎo)物阻遏(inducer exclusion)是一種C源的代謝抑制另一種C源吸收利用的現(xiàn)象。在大腸桿菌中，PTSGlc中非磷酸化形式的EIIAGlc是導(dǎo)致誘導(dǎo)物阻遏作用的關(guān)鍵信號(hào)。以大腸桿菌lac操縱子的經(jīng)典模型為例［16，19］，當(dāng)培養(yǎng)基中同時(shí)存在葡萄糖和乳糖2種C源時(shí)，葡萄糖被優(yōu)先利用，此時(shí)，磷酸基團(tuán)在PTSGlc蛋白間進(jìn)行級(jí)聯(lián)傳遞，PEP和EIIAGlc-P濃度都很低，而非磷酸化的EIIAGlc與乳糖透性酶LacY(乳糖:H+同向轉(zhuǎn)運(yùn)載體)結(jié)合使之失活，將導(dǎo)致胞外的乳糖無(wú)法轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)胞內(nèi)，使得乳糖分解代謝基因(lac操縱子)表達(dá)所需的誘導(dǎo)劑(異乳糖)無(wú)法生成，進(jìn)而抑制了乳糖的吸收和利用。當(dāng)葡萄糖被耗盡只剩下乳糖為唯一C源時(shí)，EIIAGlc主要以磷酸化形式存在，對(duì)LacY的阻遏作用被解除，使乳糖能夠被轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入胞內(nèi)。

有趣的是，Postma等［19］發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中還存在與乳糖相同類型的C源時(shí)，EIIAGlc與LacY的相互作用會(huì)被加強(qiáng)，這說(shuō)明或許還存在其他調(diào)控作用。此外，有研究調(diào)查了大腸桿菌全基因組并發(fā)現(xiàn)EIIAGlc與若干非PTSC源轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白都存在共有序列［20］，包括麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MalFGK2)、乳糖滲透酶蛋白(LacY)、蜜二糖滲透蛋白(MelB)和蜜三糖滲透蛋白(RafB)等，這說(shuō)明EIIAGlc可能通過(guò)誘導(dǎo)物阻遏作用影響更多C源的吸收和利用。

最終的CCR現(xiàn)象往往是由這2種機(jī)制共同作用的綜合結(jié)果。乳糖的吸收受EIIAGlc-P抑制的同時(shí)，lac的啟動(dòng)子還受CAP的激活［18］。當(dāng)葡萄糖吸收完全，EIIAGlc-P的抑制作用解除，且細(xì)胞內(nèi)的CAP水平提高。乳糖對(duì)lac操縱子誘導(dǎo)作用得以恢復(fù)，這是誘導(dǎo)物阻遏作用的解除以及CAP使得lac操縱子轉(zhuǎn)錄水平加強(qiáng)兩方面綜合作用的結(jié)果［5］。

1.3 PEP/PYR比率的影響

大腸桿菌中，引起碳分解代謝抑制作用的主要因素是非磷酸化形式的EIIAGlc。依賴于PTS途徑進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)的碳水化合物的內(nèi)質(zhì)化過(guò)程會(huì)提高非磷酸化形式的EIIAGlc水平，但不是唯一因素。Hogema等［21］發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌以非PTS糖類為C源時(shí)也會(huì)提高非磷酸化形式的EIIAGlc。以葡萄糖-6-磷酸為例，該糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和第一步代謝反應(yīng)不參與EIIAGlc的脫磷酸作用，糖酵解過(guò)程的后幾步反應(yīng)才是關(guān)鍵。他們對(duì)PEP和丙酮酸(pyruvate，PYR)進(jìn)行了定量監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)它們與EIIAGlc蛋白磷酸化水平有直接關(guān)系，結(jié)果表明:當(dāng)PEP/PYR比率降低時(shí)，EIIAGlc-P發(fā)生脫磷酸化作用，且這2個(gè)現(xiàn)象往往同時(shí)發(fā)生。因此，PEP/PYR的比率可能直接導(dǎo)致不同C源間的碳代謝抑制，反之該比率也受 C源新陳代謝的影響［22］。

1.4 DgsA(Mlc)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子

除了這2種以EIIAGlc磷酸化水平為信號(hào)的調(diào)控外，E.coli中還存在一些PTSGlcC源分解代謝基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，這些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子包含有PTSGlc調(diào)節(jié)域。DgsA(或Mlc)被認(rèn)為是一個(gè)轉(zhuǎn)錄水平的雙重調(diào)節(jié)因子［23］，它能調(diào)控自身 mlc基因、PTSGlc關(guān)鍵基因ptsHI、ptsG和manXYZ(編碼甘露糖的 PTS轉(zhuǎn)運(yùn)，也能親和轉(zhuǎn)運(yùn)若干其他己糖，如葡萄糖)［20，24-25］的表達(dá)。

Mlc的抑制作用和cAMP-CRP的激活作用直接與PTSGlc組分的磷酸化水平相關(guān)。C源底物對(duì)PTSGlc途徑的激活導(dǎo)致EIIBCGlc和EIIAGlc主要為非磷酸化形式。此時(shí)EIIBCGlc與Mlc結(jié)合并將Mlc與其所結(jié)合的DNA隔離開(kāi)，于是Mlc得以表達(dá)并能夠抑制PTSGlc基因的表達(dá)，并降低葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)速率［26］。而后Nam等［26］給出了EIIBCGlc-Mlc復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu):Mlc四聚物與4個(gè)膜整合蛋白EIIBCGlc結(jié)合的復(fù)合體結(jié)構(gòu)，從而進(jìn)一步揭示了Mlc的作用機(jī)制。

大腸桿菌以葡萄糖或其他能被快速利用的PTSC源(如N-acetyglucosamine和甘露糖等)為底物生長(zhǎng)時(shí)不受Mlc的抑制，非PTSC源(如乳糖、麥芽糖和蔗糖)也不受影響。而麥芽糖(非PTS糖)在一定程度上受Mlc抑制，這可能與細(xì)胞內(nèi)葡萄糖和葡萄糖-1-磷酸的濃度有關(guān)［16，19，25］。除 CRP 外，基因mlc幾乎不受其他因子的調(diào)控，Decker等［27］證實(shí)該調(diào)控過(guò)程為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。

2 CCR對(duì)E.coli混合C源利用的影響

大腸桿菌中調(diào)控CCR作用的若干途徑組成了一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，其目的主要是:①?gòu)幕旌系纳L(zhǎng)介質(zhì)中優(yōu)先利用能夠?qū)ψ陨砜焖俅x的C源;②根據(jù)細(xì)胞自身的代謝能力限制對(duì)于C源的吸收利用，避免負(fù)擔(dān)過(guò)重和能源浪費(fèi)。CCR是一個(gè)較復(fù)雜的調(diào)控過(guò)程，在不同的多C源組合中，大腸桿菌的C源利用順序以及利用速率不同?？偟膩?lái)說(shuō)是從2個(gè)角度進(jìn)行調(diào)節(jié):一是不激活次要C源的利用，二是抑制次要C源的利用?；旌螩源成分不同，C源的代謝順序、CCR現(xiàn)象形成機(jī)制以及緩解CCR影響的方法都存在差異。不論是哪種或哪幾種機(jī)制引起CCR作用，幾乎都與PTS途徑密切相關(guān)，因此針對(duì)不同的機(jī)制，對(duì)PTS進(jìn)行定向改造可以有效地緩解CCR作用(表1)。

表1 大腸桿菌中常見(jiàn)混合C源分解代謝抑制特點(diǎn)及解除方法Table 1 Feature and remove method common of carbon mixture catabolite repression in Escherichia coli

2.1 葡萄糖和乳糖

葡萄糖對(duì)乳糖的誘導(dǎo)物阻遏作用是受非磷酸化的EIIAGlc激活的。LacY蛋白結(jié)合底物中的乳糖后發(fā)生某種構(gòu)象的改變，才能與EIIAGlc發(fā)生隨后的作用。這種只有在乳糖存在時(shí)才發(fā)生的EIIAGlc-LacY的條件性結(jié)合作用，實(shí)際上避免了當(dāng)非PTS糖類不存在時(shí)對(duì) PTS 組分的浪費(fèi)［17］。Hogema 等［28］在通過(guò)添加外源的cAMP激活lac基因的表達(dá)來(lái)抵抗葡萄糖對(duì)乳糖的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌體的生長(zhǎng)受到抑制，這說(shuō)明大腸桿菌能夠耐受一定程度上的lac調(diào)控，而CCR作用的排除反而有可能對(duì)生長(zhǎng)帶來(lái)不利。

在葡萄糖和乳糖混合物中，β-半乳糖苷酶的表達(dá)往往被抑制。Deutscher等［18］分別通過(guò)在培養(yǎng)基中添加異丙基-硫代β-半乳糖苷(IPTG)、缺失crr基因或過(guò)表達(dá)LacY的方法，均消除該抑制現(xiàn)象。一些結(jié)果還表明在大腸桿菌中，葡萄糖對(duì)乳糖利用的抑制作用更主要是受cAMP-CRP水平的影響。

2.2 葡萄糖和麥芽糖

大腸桿菌利用麥芽糖時(shí)需要malE編碼的麥芽糖結(jié)合蛋白和多亞基的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MalFGK2［29-31］，該蛋白是由可溶性的MalK亞基與透性酶的2個(gè)膜結(jié)合亞基MalF和MalG緊密結(jié)合而形成［32-33］。麥芽糖結(jié)合蛋白(maltose binding protein，MBP)攜帶麥芽糖與MalFGK2結(jié)合，MalK激活A(yù)TP水解提供能量并將麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)［34-36］。麥芽糖和葡萄糖共存時(shí)，非磷酸化的EIIAGlc結(jié)合到麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MalF和MalG亞基上阻礙麥芽糖進(jìn)入胞質(zhì)［37-39］。已有研究證明了EIIAGlc和目標(biāo)蛋白結(jié)合位點(diǎn)的生物化學(xué)特性，Chen等［40］借助X線和晶體學(xué)知識(shí)首次給出了E.coli中EIIAGlc和麥芽糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)，是首次以蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)揭示了CCR的機(jī)制。

2.3 葡萄糖和木糖

葡萄糖和木糖是木質(zhì)纖維素水解液的主要成分。木糖有獨(dú)立于葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝途徑。通過(guò)大腸桿菌PTS途徑的突變(ptsIHcrr/ptsG)能明顯解除葡萄糖和木糖混合發(fā)酵時(shí)的二次生長(zhǎng)現(xiàn)象。有研究將大腸桿菌PTS-Glc+突變菌株［41］培養(yǎng)于均為1 g/L的葡萄糖、阿拉伯糖和木糖混合C源中，結(jié)果葡萄糖和阿拉伯糖首先被同時(shí)消耗，而木糖的利用被抑制直至葡萄糖和阿拉伯糖耗盡［42］。

葡萄糖和木糖是木質(zhì)纖維素水解液的主要成分，解除碳分解代謝抑制的大腸桿菌工程菌株可用于以木質(zhì)纖維素水解液為原料生產(chǎn)乙醇、乳酸和琥珀酸等生物產(chǎn)品。

但是，大腸桿菌中葡萄糖與木糖間的代謝抑制機(jī)制尚不明確，目前葡萄糖和木糖高效共利用的很多研究仍以酵母菌為宿主。盡管微生物利用混合C源發(fā)酵的研究進(jìn)展不斷被報(bào)道，要想將木質(zhì)纖維素原料更廣泛地用于微生物的生產(chǎn)發(fā)酵還需要進(jìn)一步努力。

2.4 葡萄糖和甘油

EIIAGlc與甘油激酶(glycerol kinase，GK)結(jié)合阻礙甘油-3-磷酸的產(chǎn)生，甘油-3-磷酸是甘油進(jìn)入細(xì)胞和分解代謝基因表達(dá)的誘導(dǎo)劑［43］。而 Holtman等［43］研究認(rèn)為，比起 EIIAGlc的阻遏作用，果糖-1，6-二磷酸(FBP)對(duì)甘油激酶的構(gòu)象的影響才是引起葡萄糖對(duì)甘油代謝抑制作用的最主要因素。此外，一些調(diào)控因子(如GlpR)也在一定程度上參與了CCR 過(guò)程［44-46］。

2.5 葡萄糖和 β-葡萄糖苷

在大腸桿菌中，有許多PTS底物的分解代謝受轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子調(diào)控。bgl感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)β-葡萄糖苷的代謝抑制作用。該系統(tǒng)包括一個(gè)膜結(jié)合的糖感應(yīng)器/透性酶和一個(gè)調(diào)控糖代謝基因表達(dá)的抗轉(zhuǎn)錄終止因子［47］。bgl操縱子包括 bglG、bglF和 bglB 3個(gè)基因;BglG是1個(gè)抗轉(zhuǎn)錄終止因子，其活性受BglF調(diào)控;BglF是催化β-葡萄糖苷磷酸化和內(nèi)質(zhì)化的PTS透性酶。當(dāng)存在β-葡萄糖苷為唯一C源時(shí)，BglF將磷酸基團(tuán)傳遞給β-葡萄糖苷并將其內(nèi)質(zhì)化，而HPr可以將部分磷酸基團(tuán)傳遞給BglG使其處于激活狀態(tài)，從而能夠抗 bgl轉(zhuǎn)錄終止［15，48］。當(dāng)葡萄糖和β-葡萄糖苷共存時(shí)，HPr將磷酸基團(tuán)高效地傳遞給EIIAGlc以供葡萄糖的高效吸收，BglG處于非磷酸化狀態(tài)(非激活狀態(tài))，基因bgl的轉(zhuǎn)錄被提前終止而無(wú)法正常表達(dá)β-葡萄糖苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BglF，β-葡萄糖苷的吸收受到抑制。PTS途徑中編碼HPr的ptsH基因的缺失可以使葡萄糖和β-葡萄糖苷被共同利用。

3 混合C源共利用在工程大腸桿菌中的應(yīng)用

生物質(zhì)資源包括農(nóng)作物、樹(shù)木等植物及其殘?bào)w、畜禽糞便和有機(jī)廢棄物，其中纖維素類物質(zhì)占其總量的80%以上。這些生物質(zhì)的水解產(chǎn)物是若干單糖的混合物，包括葡萄糖、阿拉伯糖和木糖等。在利用生物質(zhì)原料進(jìn)行生物制造過(guò)程中面臨一個(gè)非常重要的問(wèn)題，即在葡萄糖內(nèi)質(zhì)化的過(guò)程中，除葡萄糖以外的C源代謝過(guò)程受到消除碳分解代謝抑制作用，共利用水解液中多種C源的方法將會(huì)在生物產(chǎn)品的生產(chǎn)中占有優(yōu)勢(shì)，既能縮短發(fā)酵時(shí)間又能提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)率［3，49-51］。大腸桿菌含有許多糖轉(zhuǎn)運(yùn)及其代謝途徑，具有利用多種C源的能力。為了使葡萄糖和木糖能夠被共利用，同時(shí)利用混合糖進(jìn)行生物制造，就需要對(duì)大腸桿菌的代謝途徑進(jìn)行工程改造。主要的方法［52］包括:①消除碳分解代謝抑制，②增強(qiáng)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，③增加戊糖磷酸途徑的活性，④減少不必要的副產(chǎn)物途徑對(duì)C源的浪費(fèi)。

最早利用大腸桿菌生產(chǎn)乙醇的研究開(kāi)始于引入外源的pdcZm和adhBZm［53］。Cordaro 等［54］用磷霉素篩選出不能轉(zhuǎn)運(yùn)PTS糖的突變菌株，并發(fā)現(xiàn)這些突變大多發(fā)生在ptsI基因。接下來(lái)在這些突變株中篩選出1株糖耗速率快且能共利用葡萄糖、阿拉伯糖和木糖(初始質(zhì)量濃度均各30 g/L)的菌株進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果表明與親本菌株相比，乙醇產(chǎn)量提高了20%。而后ptsG缺陷型菌株被應(yīng)用于混合C源發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的研究中［55］。ptsG的缺失既解除了CCR作用，又能在很大程度上降低乙酸的積累，而且糖耗盡的時(shí)間僅為野生型的一半［56］。在該突變株中轉(zhuǎn)入過(guò)表達(dá)pdcZm和adhBZm'的質(zhì)粒，以LB培養(yǎng)基中添加各4 g/L的葡萄糖和木糖為發(fā)酵培養(yǎng)基得到的乙醇為35 g/L，比野生型提高了0.6%。隨后有研究在PTS-Glc-菌株中用連續(xù)培養(yǎng)的方法篩選出PTS-Glc+突變株［41］，發(fā)現(xiàn)當(dāng)其生長(zhǎng)于葡萄糖、阿拉伯糖和木糖各1 g/L的混合C源中時(shí)，不但糖耗速率加快，且發(fā)酵結(jié)束時(shí)發(fā)酵液中沒(méi)有乙酸積累。Nichols等［55］構(gòu)建了大腸桿菌工程菌株 FBR16(W3110ΔptsGΔpflΔfrdABCD，并在質(zhì)粒上過(guò)表達(dá)來(lái)自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的pdc和adhB基因)，發(fā)現(xiàn)它能夠從混合糖溶液中穩(wěn)產(chǎn)乙醇。厭氧發(fā)酵70 h(質(zhì)量分?jǐn)?shù) 3.7% 葡萄糖、3.6% 木糖和 1.9% 阿拉伯糖)，乙醇平均產(chǎn)量為(0.75 ±0.01)g/(L·h)，產(chǎn)率為0.51 g/g。這些基因工程改造大腸桿菌能夠共利用混合C源，使得以木質(zhì)纖維素水解液為原料生產(chǎn)乙醇成為可能。

L-乳酸是許多工業(yè)應(yīng)用中的化學(xué)前體［57］，可以通過(guò)在缺失大腸桿菌丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)和乳酸脫氫酶(LDH)編碼基因的雙基因突變菌株中轉(zhuǎn)入來(lái)自牛鏈球菌的乳酸脫氫酶基因來(lái)生產(chǎn)。為了同時(shí)利用多種C源生產(chǎn)乳酸，在該工程菌中進(jìn)一步敲除了ptsG基因。各以50 g/L的葡萄糖和木糖混合C源最終發(fā)酵得到乳酸產(chǎn)率為0.77 g/g，相比野生型提高了 60%［58］。隨后 Eiteman 等［59］在發(fā)酵培養(yǎng)基中同時(shí)接入2種菌株E.coli ALS1073(pflB glk ptsG manZ)(只利用木糖)和 E.coli ALS1074(pflB xylA)(只利用葡萄糖)以同時(shí)利用葡萄糖和木糖來(lái)生產(chǎn)乳酸。與以往的方法不同，這個(gè)策略雖然沒(méi)有從遺傳改造角度解除CCR作用，但完全避免了同一細(xì)胞不同C源間的分解代謝抑制作用對(duì)雙C源共利用的影響。

為了高效共發(fā)酵混合C源生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯(PHA)，Li等［60］構(gòu)建了解除 CCR 作用的 PTS 突變型大腸桿菌菌株。E.coli LR1010(引入phaCRe和 phaABRe基因)能夠共利用葡萄糖和木糖并積累短鏈PHA，而E.coli LR1120(引入 phaC1 基因)和 LR1110(PTS-，并引入phaC1基因)則能積累中長(zhǎng)鏈PHA，LR1110還能共利用葡萄糖和脂肪酸。半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(semi-quantitative reversetranscriptase-polymerase chain reaction，semi RT-PCR)結(jié)果表明，PTS途徑的改造解除了對(duì)fad基因的抑制作用。

琥珀酸被認(rèn)為是一種關(guān)鍵的平臺(tái)化學(xué)制劑，具有許多工業(yè)用途。以野生型大腸桿菌為發(fā)酵菌株時(shí)存在明顯的碳代謝抑制現(xiàn)象，不利于混合C源的高效利用以積累琥珀酸。Wang等［61］首次以玉米秸稈水解液為原料利用代謝工程E.coli生產(chǎn)琥珀酸，在野生型大腸桿菌W1485中敲除了ptsG、ldhA和pflB，并轉(zhuǎn)入過(guò)表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(ppc)的質(zhì)粒，最終得到了SD121菌株。以玉米秸稈水解液為底物(初始糖質(zhì)量濃度為44 g/L)，以SD121為發(fā)酵菌株，在3 L厭氧發(fā)酵罐里發(fā)酵84 h，琥珀酸最終產(chǎn)量為36.55 g/L，產(chǎn)率為0.83 g/g(以混合糖計(jì))。在有氧-厭氧雙階段發(fā)酵中，琥珀酸最終產(chǎn)量為 57.81 g/L，產(chǎn)率為 0.87 g/g糖混合物。比起模式化的混合C源，利用玉米秸稈水解液得到了更高的琥珀酸產(chǎn)量。這也說(shuō)明以可再生生物質(zhì)水解液為原料生產(chǎn)琥珀酸具有很好的應(yīng)用前景。

目前，利用代謝工程改造大腸桿菌以混合C源為底物進(jìn)行生物制造的方法正在日趨成熟，除了上述幾種產(chǎn)物，氨基酸和木糖醇等產(chǎn)品也可以通過(guò)類似的方法得以高效積累。隨著基因工程和發(fā)酵技術(shù)的發(fā)展，利用大腸桿菌工程菌株生產(chǎn)化學(xué)產(chǎn)品的效率逐漸提高。雖然木質(zhì)纖維素水解液目前不一定是積累某一代謝產(chǎn)物的最佳原料，但卻是一種通過(guò)生物學(xué)手段使可再生生物質(zhì)資源得以再循環(huán)的有效方法，有著重要的研究意義。

4 展望

近年來(lái)，大腸桿菌在混合雙C源中的代謝抑制機(jī)制日漸明晰，對(duì)雙C源高效共利用的方法也趨于成熟，但是2種以上C源同時(shí)存在時(shí)，大腸桿菌對(duì)C源的層級(jí)利用順序還沒(méi)有一個(gè)系統(tǒng)的研究?；蛟S將來(lái)可以將不同雙C源共利用的手段聯(lián)合起來(lái)，以應(yīng)用于更多C源混合物的共利用中。從現(xiàn)有的許多研究進(jìn)展中看到，為了解除CCR作用，對(duì)菌株進(jìn)行改造是一個(gè)有效的方法，而獲得1個(gè)PTS-Glc+突變型菌株是關(guān)鍵。目前，主要有3種方法:①對(duì)PTS-菌株在連續(xù)培養(yǎng)基中進(jìn)行適應(yīng)性篩選，篩選培養(yǎng)出既能高效吸收葡萄糖又能同時(shí)利用其他C源的菌株;②在PTS-菌株中將非PTS途徑的GalP原啟動(dòng)子替換成強(qiáng)啟動(dòng)子，或直接將大腸桿菌的galP和glk替換成能高效表達(dá)的來(lái)自Z.mobilis的同源基因;③在三重突變株(mgsA pgi ptsG)中過(guò)表達(dá)crp，從cAMP-CRP水平和誘導(dǎo)物阻遏2個(gè)方面的解除CCR作用。或許可以將不同雙C源共利用的手段聯(lián)合起來(lái)，應(yīng)用于更多C源混合物的共利用中。隨著研究者對(duì)參與碳分解代謝過(guò)程和特定生物合成途徑相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特性的逐步揭示及其在遺傳改造中的應(yīng)用，對(duì)于CCR與PTS相互關(guān)系的認(rèn)識(shí)逐漸全面和深入。然而，為了擴(kuò)大對(duì)細(xì)胞內(nèi)過(guò)程更全方面的認(rèn)識(shí)，今后還需要對(duì)這些改造菌株的蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等特性進(jìn)行更深入的分析和探究。

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