16S rDNA測(cè)序在兒童血流感染細(xì)菌性病原菌分布中的應(yīng)用

黃君華，張書(shū)婉

（1.西安醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)系，陜西 西安 710021；2.西安市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西 西安 710003）

16S rDNA測(cè)序在兒童血流感染細(xì)菌性病原菌分布中的應(yīng)用

黃君華1，張書(shū)婉2

（1.西安醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)系，陜西 西安 710021；2.西安市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西 西安 710003）

目的 探討PCR方法在分析血流感染病原菌分布中的作用，為兒童細(xì)菌性血流感染的流行病學(xué)調(diào)查提供新的思路。方法從兒科重癥監(jiān)護(hù)病房（PICU）收集100份疑似血流感染患兒的外周靜脈血進(jìn)行血培養(yǎng)，同時(shí)擴(kuò)增并測(cè)序細(xì)菌16S rDNA，比較培養(yǎng)結(jié)果與PCR結(jié)果。結(jié)果100份血液標(biāo)本中11份細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為11%；PCR法23份陽(yáng)性，陽(yáng)性率為23%，二者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.08，P＜0.05)；在23例PCR陽(yáng)性標(biāo)本中，革蘭氏陽(yáng)性球菌占65.2%，其中表皮葡萄球菌最多(6例，26.1%)，革蘭氏陰性菌占34.8%，以大腸埃希菌為主(4例，17.4%)。結(jié)論16S rDNA-PCR結(jié)合測(cè)序的方法可以很好地鑒定血流感染病原菌，與血培養(yǎng)相比能更客觀地反映病原菌分布，可作為一種新的流行病學(xué)方法在臨床應(yīng)用；兒科重癥監(jiān)護(hù)病房血流感染病原菌以革蘭氏陽(yáng)性球菌為主，尤以表皮葡萄球菌最常見(jiàn)。

血流感染；16S核糖體核糖核酸；細(xì)菌；測(cè)序；兒童

血流感染(Bloodstream Infection，BSI)是一種嚴(yán)重的全身感染性疾病，病原微生物在循環(huán)血液中呈一過(guò)性、間歇性或持續(xù)性存在，并引起機(jī)體損害和臨床癥狀[1]。近30年來(lái)，隨著免疫制劑的廣泛使用及侵入性治療的廣泛開(kāi)展，兒童血流感染的發(fā)病率正在日益上升，病死率也很高[2]。目前，血流感染的診斷及病原菌分布的流行病學(xué)資料來(lái)源主要依靠血培養(yǎng)(Blood Cultivation,BC)，然而由于血培養(yǎng)耗時(shí)長(zhǎng)，陽(yáng)性率低，使所得到的統(tǒng)計(jì)學(xué)資料與客觀現(xiàn)實(shí)有一定的差距。本研究旨在通過(guò)對(duì)疑似血流感染標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)和16S rDNA通用引物PCR，比較二者的陽(yáng)性率及病原菌分布上的差異，為兒童細(xì)菌性血流感染的流行病學(xué)調(diào)查提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年10月至2013年5月在西安市兒童醫(yī)院PICU住院的疑似血流感染患兒(發(fā)熱＞38℃或低體溫＜36℃，可伴有寒戰(zhàn)等全身中毒癥狀或中性粒細(xì)胞增多伴核左移等)血標(biāo)本100份；嚴(yán)格按照無(wú)菌操作流程采集患兒外周靜脈血6 ml，其中2 ml注入BD公司EDTA-K2抗凝管，4 ml注入兩瓶?jī)和瘜Ｓ醚囵B(yǎng)瓶（2 ml/瓶）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌總DNA的提取 將2 ml血液標(biāo)本離心5 min，取沉淀，應(yīng)用QIAamp Blood DNA Mini Kit試劑盒（QIAGEN，Cat.No.51106），操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 引物序列參照Campbel等[3]和Xu等[4]設(shè)計(jì)，PSL(f)：AGGATTAGATACCCTGGTAGTCCA，XB4(r)：GTGTGTACAAGGCCCGGGAAC-3，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為615 bp。25μl PCR反應(yīng)體系，包括：10×buffer 2.5μl，10 mmol/L dNTP 0.25μl，25 mmol/L MgCl22.5μl，3.3μmol/L PSL、XB4各0.5μl，Taq酶(5 U/μl)0.125μl，DNA模板1μl，ddH2O 17.625μl。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性96℃10 min；96℃變性1 min，退火溫度55℃1 min，延伸72℃1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳的電壓為6 V/cm，采用溴化乙錠(EB)染色20 min，后在凝膠成像分析系統(tǒng)拍照保存。

1.2.3 細(xì)菌培養(yǎng) 將兒童專用血培養(yǎng)瓶放入全自動(dòng)血培養(yǎng)儀BACK-ALERT 3D進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)陽(yáng)性瓶細(xì)菌經(jīng)VITEK鑒定到種。

1.2.4 測(cè)序比對(duì) 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后送上海生工生物工程有限公司測(cè)序，登陸http://www.ncbi.nlm. nih.gov/blast/Blast.cgi，將測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用配對(duì)四格表資料的χ2檢驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)和PCR方法的陽(yáng)性率進(jìn)行比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 16S rDNA通用引物擴(kuò)增臨床標(biāo)本 16S rDNA通用引物的擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期片段大小(615 bp)相符合(見(jiàn)圖1)。

圖1 16S rDNA通用引物擴(kuò)增臨床標(biāo)本

2.2 兩種不同方法檢測(cè)結(jié)果 100份血液標(biāo)本中11份細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為11%；PCR法23份陽(yáng)性，陽(yáng)性率為23%，二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2= 10.08，P＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1 血流感染16S rDNA-PCR與血培養(yǎng)敏感度比較（份）

2.3 PCR與血培養(yǎng)檢出病原菌分布 在23例PCR陽(yáng)性標(biāo)本中革蘭氏陽(yáng)性球菌占65.2%，其中表皮葡萄球菌最多(6例，26.1%)，革蘭氏陰性菌占34.8%，以大腸埃希菌為主(4例，17.4%)，見(jiàn)表2。

表2 16S rDNA-PCR與血培養(yǎng)檢測(cè)血流感染病原菌分布[株(%)]

3 討 論

血流感染時(shí)細(xì)菌侵入血液循環(huán)并大量繁殖，是一種嚴(yán)重的細(xì)菌感染性疾病。傳統(tǒng)血培養(yǎng)不僅是目前診斷血流感染的金標(biāo)準(zhǔn)，而且也是一個(gè)重要的流行病學(xué)工具，血培養(yǎng)得到的統(tǒng)計(jì)學(xué)資料（病原菌分布及藥敏資料）常作為臨床醫(yī)生經(jīng)驗(yàn)性治療的依據(jù)。然而，血培養(yǎng)本身存在的局限性導(dǎo)致其所得到的血流感染病原菌分布資料與客觀情況有較大的差異。

兒童血流感染以ICU的檢出率最高[5]，因此本研究選取PICU患兒作為研究對(duì)象，共收集100份血液標(biāo)本，用細(xì)菌16S rDNA通用引物擴(kuò)增測(cè)序，所用引物PSL/XB4具有很高的檢測(cè)靈敏度，能夠達(dá)到1.5× 102CFU/ml[6]。100份標(biāo)本中血培養(yǎng)陽(yáng)性11例，而PCR方法陽(yáng)性23例，PCR陽(yáng)性率(23%)是血培養(yǎng)陽(yáng)性率(11%)的2.09倍，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯示PCR方法檢測(cè)陽(yáng)性率高于培養(yǎng)方法。

本組資料結(jié)果顯示，對(duì)于PICU患兒，PCR方法檢測(cè)的病原菌數(shù)量和種類(lèi)多于血培養(yǎng)，以表皮葡萄球菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和溶血葡萄球菌為主，而血培養(yǎng)方法所檢測(cè)的病原菌主要是表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌和大腸埃希菌。由結(jié)果可知，PCR方法所得到的病原菌分布與培養(yǎng)結(jié)果略有差異，如果增加樣本量并避免假陽(yáng)性，則PCR方法所得到的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果能更加客觀全面地反映血流感染細(xì)菌性病原菌分布。

引起血流感染的病原菌種類(lèi)廣泛。近20年來(lái)，凝固酶陰性葡萄球菌等革蘭氏陽(yáng)性菌和大腸埃希菌引起的血流感染發(fā)病率增加[7]。本研究顯示，2012年10月至2013年5月在西安市兒童醫(yī)院PICU血流感染以革蘭氏陽(yáng)性球菌最多(占65.2%)，這與徐月波等[5]的報(bào)道一致，而Abou Elella等[8]的研究認(rèn)為兒童心臟ICU血流感染主要病原菌為革蘭氏陰性菌。本組資料顯示表皮葡萄球菌(占26.1%)是PICU血流感染的首位病原菌，這與徐月波及Luthander等[5，9]的報(bào)道有一定的差異，而與Lv等[10]的研究一致。在本研究中革蘭氏陰性菌占34.8%，以大腸埃希菌為主(占17.4%)，與Al-Hasan[11]的報(bào)道一致，其他為非發(fā)酵菌(占17.4%)；革蘭氏陽(yáng)性菌以葡萄球菌屬為主(占52.2%)，其中凝固酶陰性葡萄球菌占39.1%。上述資料說(shuō)明不同檢測(cè)方法、不同年代、不同地域、不同科室、不同年齡段兒童血流感染的病原菌分布有一定的差異。

綜上所述，為了獲得更加客觀真實(shí)的血流感染細(xì)菌性病原菌分布，本研究直接從全血標(biāo)本中提取細(xì)菌基因組DNA，并應(yīng)用通用引物PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因部分片段，通過(guò)測(cè)序來(lái)鑒定病原菌種類(lèi)，從而用分子生物學(xué)方法得到血流感染細(xì)菌菌譜，為得到更加準(zhǔn)確完善的統(tǒng)計(jì)學(xué)資料提供了一種新的思路和方法。此外，細(xì)菌性病原菌因時(shí)間、地區(qū)、科室的不同而有不同的分布，每個(gè)地區(qū)或醫(yī)院應(yīng)該建立自己的血流感染病原菌分布數(shù)據(jù)庫(kù)，這可以更好地指導(dǎo)本院合理地診斷血流感染和選擇抗生素。

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Analysis of etiology of bloodstream infection in children by sequencing the 16S rDNA.

HUANG Jun-hua1,ZHANG Shu-wan2.1.Department of Medical Technology,Xi'an Medical University,Xi'an 710021,Shaanxi,CHINA;2. Clinical Laboratory,Xi'an Children's Hospital,Xi'an 710003,Shaanxi,CHINA.

Objective To explore the value of PCR for analyzing the pathogenic spectrum of bloodstream infection(BSI)in children,and to provide a new thought for epidemiological survey of BSI.MethodsA total of 100 patients in PICU with suspected bacterial infections were included,and then performed blood cultivation(BC)and analyzed by 16S rDNA-PCR following by sequencing and BLAST.At the same time,the results of two methods were compared.ResultsAmong the 100 specimens,the positive rate of BC and PCR are 11%and 23%,respectively. There was significant difference between the two methods(χ2=10.08,P＜0.05).Gram-positive bacteria and Gram-negative bacteria accounted for 65.2%and 34.8%,respectively,in 23 bacteria.The predominant pathogens were Staphylococcus epidermidis(26.1%),followed by Escherichia coil(17.4%).Conclusions Compared with BC,16S rDNA-PCR and sequencing which provide a new way of analyzing the pathogenic spectrum of BSI might be effective for epidemiological investigation.The pathogens of BSI are mainly gram-positive bacteria in PICU,and Staphylococcus epidermidis is the most common one.

Bloodstream Infection;16S rDNA;Bacteria;Sequencing;Child

R725.5

A

1003—6350（2014）10—1467—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.10.0564

2013-12-04)

黃君華。E-mail：huangjunhua1985@163.com