超聲對荔枝汁中TAB的殺菌效果研究

黃 瑞 余小林 胡卓炎 江杏心

HUANG Rui YU Xiao－lin HU Zuo－yan JIANG Xing－xin

楊澤嘉 紀(jì)麗純

YANG Ze－jiaJI Li－chun

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642）

（College of Food Science South China Agricultural University，Guangzhou，Guangdong 510642，China）

酸土脂環(huán)芽孢桿菌（Alicyclobacillus acidoterrestris）屬革蘭氏陽性芽孢桿菌，具有嗜酸、耐熱的特點。它是造成巴氏滅菌果汁（p H 2.5～5.5）腐敗的主要原因之一［1］，其引起的腐敗特征是產(chǎn)生具有特殊氣味的愈創(chuàng)木酚、鹵酚等酚類代謝物而嚴(yán)重影響果汁的風(fēng)味和口感，有時可導(dǎo)致果汁的濁度升高甚至在產(chǎn)品底部形成白色沉淀［2］，由此給生產(chǎn)企業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失，并給消費者的健康安全帶來隱患。2000年起，國際貿(mào)易中嚴(yán)格要求每10 m L濃縮果汁中其含量小于1個，美國及歐洲大部分國家從2002年起要求在濃縮果汁中不得檢出酸土脂環(huán)芽孢桿菌。目前，國內(nèi)外針對蘋果汁、橙汁、橘汁等溫帶果蔬汁及混合果蔬汁中酸土脂環(huán)芽孢桿菌的研究有較多報道［3，4］，而針對荔枝汁、芒果汁、木瓜汁等亞熱帶果汁中酸土脂環(huán)芽孢桿菌的殺菌研究很少。荔枝是嶺南特色水果，荔枝汁是除荔枝干外的最大加工產(chǎn)品，濃縮荔枝汁主要用于出口，對提高荔枝的經(jīng)濟價值有很大作用。荔枝汁的成分體系適合酸土脂環(huán)芽孢桿菌生長，該菌有存在于荔枝汁中的可能性。然而，傳統(tǒng)的巴氏殺菌方法不僅有可能使酸土脂環(huán)芽孢桿菌殘存，而且還會使荔枝汁等亞熱帶果汁加熱后的風(fēng)味、顏色等品質(zhì)變劣，況且酸土脂環(huán)芽孢桿菌能夠耐受高溫，瞬時高溫滅菌過程不能致死［5］，這使亞熱帶果汁的生產(chǎn)有可能面臨新的問題，與蘋果汁等其它果汁一樣，成為中國果汁拓展國內(nèi)外市場的風(fēng)險因素之一。

超聲殺菌作為一種冷殺菌方式，近年在果蔬加工中的應(yīng)用研究有較多報道［6－8］。超聲具有的空化作用能夠在極短的時間內(nèi)殺滅和破壞微生物，該作用在液體中產(chǎn)生的局部瞬間高溫及溫度交替變化、局部瞬間高壓和壓力變化，使液體中某些細(xì)菌致死、病毒失活，甚至使體積較小的某些微生物的細(xì)胞壁破壞［7］；由于超聲處理不需要加熱，因而可保持果汁等食品原有滋味和風(fēng)味［8］。然而超聲波對酸土脂環(huán)芽孢桿菌的殺菌效果目前尚未見報道，因此本研究以荔枝汁為原料，人為將酸土脂環(huán)芽孢桿菌添加于荔枝汁中，探討在荔枝汁的物質(zhì)成分體系下，不同超聲處理對酸土脂環(huán)芽孢桿菌的殺滅效果，同時比較超聲殺菌和水浴加熱殺菌對荔枝汁品質(zhì)的影響。旨在為超聲技術(shù)在果蔬汁中的應(yīng)用提供依據(jù)，同時進一步深入對酸土脂環(huán)芽孢桿菌的研究。

1 材料及方法

1.1 材料及處理

荔枝汁的制備：品種為懷枝，市售。將新鮮荔枝清洗干凈后去皮、去核、榨汁、過濾；取過濾后荔枝汁50 m L，加入菌液濃度為105～106CFU／m L的酸土脂環(huán)芽孢桿菌菌懸液，然后進行超聲殺菌處理；

酸土脂環(huán)芽孢桿菌：取自廣東省微生物菌種保藏中心，將其接種于BAM培養(yǎng)基、活化后于4℃保存；

BAM培養(yǎng)基：按美國模式培養(yǎng)物集存庫（American type culture collection）標(biāo)準(zhǔn)配置。

1.2 試驗儀器

超聲波細(xì)胞破碎機：SCIENTZ－ⅡD型，寧波新芝生物科技有限公司；

超凈工作臺：SW－CJ－1FD型，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；

溫度梯度恒溫箱：MTI－201B型，日本Eyela公司；

手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋：SYQ－DSX－280B型，上海申安醫(yī)療器械廠；

生物顯微鏡：XSP－16A型，江南光學(xué)儀器廠；

雙層恒溫振蕩器：ZWY－A2102C型，上海智城分析儀器制造有限公司；

色差計：CM－3500d型，日本美能達公司；

電熱恒溫水浴鍋：DK－SD型，上海一恒科技有限公司。

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 超聲殺菌試驗設(shè)計

（1）單因素試驗：超聲功率的單因素試驗分別取0，100，200，300，400，500，600 W，固定超聲時間為5 min、超聲間歇時間為5 s；超聲時間的單因素試驗分別取0，1，3，5，7，9，11，13，15 min，固定超聲功率為400 W、超聲間歇時間為5 s；超聲間歇時間的單因素試驗分別取1，3，5，7，9 s，固定超聲功率為400 W、超聲時間為5 min；果汁p H的單因素試驗分別用檸檬酸將果汁p H 調(diào)節(jié)為3.5，3.7，3.9，4.1，4.3以及未調(diào)節(jié)原液，固定超聲時間5 min、超聲功率400 W、超聲間隔時間5 s。以各單因素條件處理荔枝汁，考察不同超聲處理因素對荔枝汁中酸土脂環(huán)芽孢桿菌殺菌效果的影響。

（2）響應(yīng)面試驗：在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Design Expert 8.05試驗設(shè)計軟件，利用響應(yīng)面方法（RSM）中Box－Behnken設(shè)計（BBD），進行超聲處理的條件優(yōu)化。

1.3.2 水浴加熱殺菌 取按1.1制備的荔枝汁50 m L置于滅菌后玻璃瓶中，在90℃水浴中加熱滅菌10 min。

1.4 分析方法

1.4.1 酸土脂環(huán)芽孢桿菌數(shù)目測定 將各處理前后的荔枝汁1 m L稀釋梯度后，涂布于BAM瓊脂平板培養(yǎng)基，在50℃恒溫培養(yǎng)48 h、計數(shù)；根據(jù)處理前后的酸土脂環(huán)芽孢桿菌數(shù)目，按式（1）計算酸土脂環(huán)芽孢桿菌殺菌率。

式中：

W——酸土脂環(huán)芽孢桿菌殺菌率，%；

C——超聲處理后的酸土脂環(huán)芽孢桿菌數(shù)，CFU／m L；

C0——超聲處理前的酸土脂環(huán)芽孢桿菌數(shù)，CFU／m L。

1.4.2 果汁品質(zhì)指標(biāo)的測定 Vc按照 GB 6195－1986（2，6－二氯靛酚滴定法）進行測定；總酸按照GB／T 12456－2008（酸堿滴定法）進行測定；總糖和還原糖按照參考文獻［9］的方法測定；色差值的測定取各處理荔枝汁10 m L于專用的測色皿中，用色差儀測定△E，L，a，b。

1.4.3 數(shù)據(jù)處理與分析 以上各指標(biāo)測定均為3平行，分別取其平均值，并采用 Excel 2010 和 SPSS（statistical product and service solutions）對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗的結(jié)果

超聲處理單因素條件對荔枝汁酸土脂環(huán)芽孢桿菌的殺菌效果見圖1。由圖1（a）可知，隨著超聲功率的升高，殺菌率先上升后略有下降，在400 W處達到最大值為89.17%，在600 W處為79.83%。這是因為一定范圍內(nèi)增加超聲功率，可促進空化作用，并使空化導(dǎo)致的一定熱效應(yīng)、空化機械作用增強，從而增強殺菌效果；而超過該范圍時，功率過大反而使空化泡不易產(chǎn)生，故表現(xiàn)為殺菌效果不隨之增加，周麗珍等［10］對超聲殺菌研究也有類似結(jié)果，因此，其余單因素試驗均采用400 W的超聲功率。

由圖1（b）可知，隨著超聲時間的增加，殺菌率呈上升趨勢，超聲時間為9 min時殺菌率為91.62%，15 min時殺菌率為96.78%，兩者之間的殺菌率差異為5.16%。雖然超聲作用時間對微生物致死有一定差異，但超聲15 min的殺菌率僅比9 min提高了5.63%，考慮到長時間超聲處理會使果汁升溫，對果汁中熱敏性成分產(chǎn)生影響，對機器的損耗也較大，故選取超聲處理時間為9 min進行其余試驗。

超聲間隔時間反映的是超聲連續(xù)工作的時間，由圖1（c）可知，改變超聲間隔時間，對殺菌率的影響表現(xiàn)為先略有上升后略有下降的趨勢，變化范圍在75.07%～85.07%；在間隔時間5 s處出現(xiàn)轉(zhuǎn)折點，此時的殺菌率達到最小值為85.07%。

由圖1（d）可知，未調(diào)節(jié)p H的原液經(jīng)超聲處理后的殺菌率為87.07%，除p H 3.7條件下殺菌率比未調(diào)節(jié)小外，其余各p H調(diào)節(jié)條件下的殺菌率均比原液大。

圖1 不同超聲條件對荔枝汁酸土脂環(huán)芽孢桿菌的殺菌效果Figure 1 Sterilizing effect of different ultrasound conditions on Alicyclobacillus acidoterrestris in Litchi Juice

利用SPSS軟件分別對超聲條件進行AVOAN分析，結(jié)果為：超聲時間對殺菌效果影響極顯著（P＜0.01），超聲功率和超聲間隔時間對殺菌效果影響顯著（P＜0.05），果汁p H對殺菌效果影響不顯著。

2.2 超聲處理響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.2.1 回歸模型的建立及顯著性檢驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以超聲功率、超聲間歇時間、超聲時間為自變量，以殺菌率為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面試驗。因素水平設(shè)計見表1，試驗結(jié)果見表2，方差分析見表3。

根據(jù)表2結(jié)果，利用Design Expert 8.05軟件對所得數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到多元二次回歸模型：

表1 Box－Behnken試驗設(shè)計因素及水平Table 1 Factors and levels of Box－Benhnken lest

由表3可知，一次項X2影響極其顯著，X1、X3影響顯著，表明超聲時間、超聲功率、超聲間隔時間均對殺菌率的線性效應(yīng)顯著；二次項X1影響極其顯著，X2影響高度顯著，X3影響顯著，交互項X2X3影響顯著。回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2＝0.987 1，P值為0.000 3，回歸方程模型達到顯著水平，且失擬項不顯著，說明該模型與實際情況擬合度良好。同時，由F值大小可以判斷，在所選擇的因素范圍內(nèi)，各因素對結(jié)果的影響排序為超聲時間＞超聲功率＞超聲間隔時間。

表2 Box－Behnken設(shè)計試驗結(jié)果Table 2 Box－Behnken experimental design arrangement and responses

2.2.2 響應(yīng)曲面分析 由圖2可知，隨著超聲功率、超聲時間、超聲間隔時間的增加，殺菌率逐漸上升；但繼續(xù)增加超聲功率、超聲時間、超聲間隔時間，殺菌率開始下降。綜合分析可知，超聲功率與超聲時間、超聲時間與超聲間隔時間交互作用顯著，超聲功率與超聲間隔時間交互作用不顯著，且在超聲功率360～410 W、超聲時間6.8～8.3 min、超聲間隔時間4.5～5.3 s范圍內(nèi)具有最大響應(yīng)值。

表3 回歸與方差分析結(jié)果Table 3 Results of regression and variance analysis

表3 回歸與方差分析結(jié)果Table 3 Results of regression and variance analysis

＊＊＊差異極其顯著，P＜0.001；＊＊差異高度顯著，P＜0.01；＊差異顯著，P＜0.05。R 2＝0.987 1，R＝0.963 7，信噪比＝17.535。

方差來源 平方和 自由度 均方 F值 P 顯著性模型 389.15 9 43.24 42.36 0.000 3 ＊＊＊X1 12.78 1 12.78 12.52 0.016 6 ＊X2 168.91 1 168.91 165.46＜0.000 1 ＊＊＊X3 12.43 1 12.43 12.17 0.017 5 ＊X1 X2 3.69 1 3.69 3.61 0.115 8 X1 X3 0.016 1 0.016 0.015 0.906 4 X2 X3 7.78 1 7.78 7.63 0.039 8 ＊X 12 149.69 1 149.69 146.63＜0.000 1 ＊＊＊X 22 37.80 1 37.80 37.03 0.001 7 ＊＊X32 14.95 1 14.95 14.64 0.012 3 ＊殘差項 5.10 5 1.02失擬項 3.92 3 1.31 2.20 0.327 8純誤差 1.19 2 0.59總誤差 394.26 14

2.2.3 最優(yōu)條件的確定及驗證實驗 根據(jù)Design Expert 8.05軟件分析，得出超聲殺滅荔枝汁中酸土脂環(huán)芽孢桿菌的最佳處理條件為：超聲功率385 W、超聲時間7.69 min、超聲間隔時間4.89 s，在此條件下模型預(yù)測的最大殺菌率為92.16%?？紤]到實際操作情況，將此最佳殺菌條件修正為超聲功率400 W、超聲時間7.5 min、超聲間隔時間5 s，進行驗證實驗，共3次，測得該條件下酸土脂環(huán)芽孢桿菌的殺菌率的平均值為92.25%，與模型預(yù)測值的誤差為0.466%，表明模型與實測的吻合度良好，說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，得到的回歸方程具有一定的實際意義。

2.3 超聲處理對荔枝汁品質(zhì)的影響

為考察超聲處理對荔枝汁營養(yǎng)成分的影響，選取同一批荔枝汁，按上述殺菌方法，測定了在優(yōu)化條件處理前后荔枝汁的Vc、總酸、總糖、還原糖以及色差值，并與90℃水浴加熱殺菌進行比較，結(jié)果見表4。由表4可知，加熱殺菌的殺菌率為90.66%，超聲殺菌的殺菌率為92.25%，即超聲殺菌效果優(yōu)于加熱殺菌。超聲波殺菌后荔枝汁Vc、總酸、總糖、還原糖的降低程度均小于加熱殺菌，色差值△E，b的變化也小于加熱殺菌，視覺上可觀察到加熱殺菌后荔枝汁色澤變暗程度遠遠大于超聲殺菌。超聲殺菌主要是利用超聲波的空化作用，對熱敏強的Vc損失較小，而加熱殺菌由于溫度升高促進了Vc的分解。結(jié)果表明超聲殺菌能有效地保持荔枝汁的營養(yǎng)品質(zhì)和果汁原有色澤。

圖2 不同因素兩兩交互作用對殺菌效果影響的響應(yīng)曲面分析Figure 2 Response surface analysis of significant effective interacti on items of ultrasonic power，ultrasonic treatment time and ultrasonic intermittent time on sterilization

表4 不同殺菌方式處理的荔枝汁各品質(zhì)指標(biāo)Table 4 Different sterilization methods on quality indicators in litchi juice

3 結(jié)論

（1）通過響應(yīng)曲面分析得到超聲殺滅荔枝汁中酸土脂環(huán)芽孢桿菌的最佳處理條件為：超聲功率400W、超聲間隔時間5 s、超聲時間7.5 min；在該條件下，酸土脂環(huán)芽孢桿菌的殺菌率為92.25%。

（2）超聲殺菌對荔枝汁Vc、糖酸以及色澤的影響程度小于加熱殺菌。

（3）在最佳超聲條件下，酸土脂環(huán)芽孢桿菌殺菌率92.25%仍無法達到果汁國際貿(mào)易的要求（＜1個／10 m L），需要進一步研究超聲與其他殺菌方式的聯(lián)用。

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