氧載體對(duì)恩拉霉素發(fā)酵合成的影響

劉 蕊 陳 敏 王 宏

LIU Rui 1 CHEN Min 1 WANG Hong 2

（1.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310012；2.浙江凱勝生物藥業(yè)有限公司，浙江 蘭溪 321100）

（1.College of Food Science ＆ Bioengineering，Zhejiang Gongshang University，Hangzhou，Zhejiang 310012，China；2.Zhejiang Chyszern Biological Pharmaceutical Co.，Ltd，Lanxi，Zhejiang 321100，China）

恩拉霉素（enramycin）是1966年由日本武田藥品工業(yè)株式會(huì)社研究員從日本兵庫(kù)縣西宮市的土壤中分離出來的一株殺真菌鏈霉菌Streptomyces fungicidious NO.B－5477產(chǎn)生的一種多肽類抗生素［1－3］，具有廣譜抗革蘭氏陽性菌特性和優(yōu)良的促生長(zhǎng)性、改善飼料利用率的作用，且不易與其他抗生素產(chǎn)生交叉耐藥性［4］。目前，對(duì)于發(fā)酵法生產(chǎn)恩拉霉素，國(guó)內(nèi)外主要集中在高產(chǎn)菌種的選育、培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化方面的研究［5－7］。

恩拉霉素是胞內(nèi)產(chǎn)物，所以恩拉霉素生產(chǎn)菌的生物量對(duì)于恩拉霉素產(chǎn)量的提高至關(guān)重要。恩拉霉素的生產(chǎn)菌隸屬于鏈霉菌屬，是好氧微生物，它的生長(zhǎng)和恩拉霉素的合成都需要大量的氧氣。但由于恩拉霉素發(fā)酵生產(chǎn)過程中使用的培養(yǎng)基固形物含量高，黏度大，生產(chǎn)過程中菌絲體易結(jié)團(tuán)，導(dǎo)致發(fā)酵系統(tǒng)的溶氧速率較低。如果加大攪拌速率來增加溶氧量，則剪切力會(huì)增大，造成菌絲體的損傷，生產(chǎn)能力下降。因此在實(shí)驗(yàn)室及企業(yè)工業(yè)化生產(chǎn)中供氧成為提高恩拉霉素產(chǎn)量的主要限制因素之一。

近年來不少研究機(jī)構(gòu)采用一些新方法來改善發(fā)酵過程中的氧傳遞問題，以提高細(xì)胞和產(chǎn)物濃度，如氧載體。有文獻(xiàn)［8－10］表明，加入氧載體，可利用氧氣在其中的高溶解度特性，將它們引入發(fā)酵液來降低傳質(zhì)阻力。氧載體發(fā)酵體系由于氧傳遞速度快，能耗低，氣泡生成少，剪切力小的特點(diǎn)，受到廣泛的應(yīng)用。通常使用的氧載體有：液態(tài)烷烴、油酸、甲苯、全氟化碳、豆油等［11－14］。本研究擬考察不同氧載體對(duì)恩拉霉素發(fā)酵的影響，對(duì)其中效果最優(yōu)的氧載體的添加時(shí)間和添加量進(jìn)行單因素比較和響應(yīng)面優(yōu)化［15］，以期為將其進(jìn)一步應(yīng)用于擴(kuò)大發(fā)酵奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

Streptomyces fungicidious KS 010：浙江凱勝科技有限公司。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

全溫振蕩培養(yǎng)箱：HZ－F160型，太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；

立式壓力蒸汽滅菌鍋：YXQ－LS－75Ⅱ型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

高效液相色譜儀：2478 DualλAbsorbance Detector，600 controller，717 plus Autosampler，Empower色譜工作站，美國(guó)Waters公司；

p H計(jì)：DELTA 320型，梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司；

生化培養(yǎng)箱：SHP－250型，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基及主要試劑

斜面培養(yǎng)基：可溶性淀粉 20.0 g／L，KNO31.0 g／L，K2HPO40.5 g／L，MgSO4·7H2O 0.5 g／L，NaCl 0.5 g／L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g／L，瓊脂20.0 g／L，p H 7.2～7.4；

種子培養(yǎng)基：玉米漿3.5%，可溶性淀粉3.5%，玉米蛋白粉0.5%，CaCO32.0%，適量泡敵，消后p H 7.0；

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖5.03%，玉米淀粉3.5%，玉米漿2.0%，玉米蛋白粉 3.0%，NH4Cl 0.50%，NaCl 1.50%，酵母膏1.2%，K2HPO43H2O 0.15%，ZnCl20.12%，α－淀粉酶0.1%80～90℃糊化20～30 min，加 CaCO31.5%，適量泡敵，消后p H 7.0～7.5；

恩拉霉素預(yù)混劑（對(duì)照品）：含量10%，浙江海正藥業(yè)股份有限公司；

Tween－80、乙酸乙酯、油酸、正十六烷、甲醇、丙酮：分析純，浙江匯普化工儀器有限公司；

玉米蛋白粉、玉米漿、玉米淀粉、α－淀粉酶、豆油（食用級(jí)）：浙江凱勝科技有限公司；

乙腈：色譜純，Honeywell Burdick ＆Jackson，USA。

1.2 培養(yǎng)方法

（1）種子擴(kuò)培：取斜面活化菌種，接種于100 m L種子培養(yǎng)基中。28℃，200 r／min，搖瓶培養(yǎng)48 h。

（2）發(fā)酵培養(yǎng)：取種子擴(kuò)培液，按15%（V／V）的接種量接 種 于 發(fā) 酵 培 養(yǎng) 基 中。33 ℃［7］，200 r／min，搖 瓶 培養(yǎng)10 d［7］。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 HPLC法測(cè)定恩拉霉素含量 準(zhǔn)確量取一定體積發(fā)酵液，使用細(xì)胞破碎儀破碎10 min，將破碎后發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至100 m L容量瓶中，用浸提液定容至刻度，搖勻后28℃靜置30 min。取出后4 000 r／min離心15 min，得上清液備用。

采用Waters液相色譜儀分析，色譜柱為C18色譜柱（5μm，4.6 mm ×250 mm），流動(dòng)相為30%乙腈和70%的0.05 mol／L的 KH2PO4水 溶 液 （p H 4.5），檢 測(cè) 波 長(zhǎng)268 nm，流速1.0 m L／min［7］。

1.3.2 菌體濃度的測(cè)定 準(zhǔn)確量取一定體積培養(yǎng)一定時(shí)間的發(fā)酵液于50 m L離心管中，8 000 r／min下離心5 min，倒出上清液，準(zhǔn)確量取上清液體積。按式（1）計(jì)算菌體濃度：

1.4 氧載體優(yōu)化試驗(yàn)

1.4.1 氧載體的選擇 選擇Tween－80、油酸、乙酸乙酯、正十六烷作為待測(cè)氧載體，在搖瓶發(fā)酵初始分別添加2%的量，以不添加氧載體為對(duì)照。在轉(zhuǎn)速200 r／min，33℃的條件下培養(yǎng)10 d。通過測(cè)定各搖瓶菌體濃度和恩拉霉素相對(duì)含量，篩選促進(jìn)恩拉霉素合成的最適氧載體。

1.4.2 最適氧載體添加量試驗(yàn) 在確定了氧載體的基礎(chǔ)上，在發(fā)酵初始向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.5%，1.0%，2.0%，4.0%，8.0%的最適氧載體，以不添加氧載體為對(duì)照，在轉(zhuǎn)速200 r／min，33℃的條件下培養(yǎng)10 d。通過測(cè)定各搖瓶菌體濃度和恩拉霉素相對(duì)含量，確定最適氧載體的最佳添加量。

1.4.3 最適氧載體添加時(shí)間試驗(yàn) 在最適氧載體添加量試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，考察不同時(shí)間添加最適氧載體對(duì)恩拉霉素發(fā)酵的影響。試驗(yàn)中分別在0，2，4，6 d 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)向發(fā)酵液中加入最佳濃度的氧載體，以不添加氧載體作為對(duì)照，在轉(zhuǎn)速200 r／min，33℃的條件下培養(yǎng)10 d。通過測(cè)定各搖瓶菌體濃度和恩拉霉素含量，確定最適氧載體的最佳添加時(shí)間。

1.4.4 二階響應(yīng)曲面優(yōu)化最適氧載體添加方式 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以最適氧載體的加入量和加入時(shí)間為中心，體系中恩拉霉素產(chǎn)量Y為目標(biāo)響應(yīng)值，采用二階響應(yīng)曲面優(yōu)化最適氧載體的添加量和添加時(shí)間，獲得最優(yōu)的添加方式。

1.4.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 以二階響應(yīng)曲面優(yōu)化所得到的最優(yōu)添加方式重復(fù)驗(yàn)證3次，根據(jù)所得恩拉霉素含量的平均值與理論值間的差異，評(píng)價(jià)二階響應(yīng)模型的正確性。

2 結(jié)果與討論

2.1 最適氧載體的選擇

根據(jù)1.4.1項(xiàng)中方法進(jìn)行試驗(yàn)，比較不同氧載體對(duì)恩拉霉素發(fā)酵的影響，不同氧載體體系得到的菌體濃度和恩拉霉素的相對(duì)含量結(jié)果見表1。

表1 添加不同種類氧載體對(duì)恩拉霉素發(fā)酵的影響Table 1 Effects of different oxygen－vectors on fermentation production of enramycin

由表1可知，以菌體濃度為指標(biāo)，添加2%的乙酸乙酯、豆油和正十六烷試驗(yàn)組的菌體濃度均高于對(duì)照組，其中添加正十六烷試驗(yàn)組的菌體濃度可以達(dá)到53%，高于對(duì)照組13%。而添加Tween－80和油酸的試驗(yàn)組的菌體濃度均低于對(duì)照組。可見并不是所有的氧載體都可以提高恩拉霉素生產(chǎn)菌的菌體濃度。以恩拉霉素相對(duì)含量為指標(biāo)，添加2%的豆油和正十六烷試驗(yàn)組的恩拉霉素相對(duì)含量均高于對(duì)照組，分別提高了39.57%和62.74%，說明這兩種氧載體均可以提高恩拉霉素產(chǎn)量，并且對(duì)菌體生長(zhǎng)無影響。而添加相同濃度的Tween－80、油酸試驗(yàn)組的恩拉霉素相對(duì)含量均比對(duì)照組低，說明這兩種有機(jī)溶劑抑制菌體的生長(zhǎng)，進(jìn)而影響恩拉霉素的合成，可能是這些有機(jī)溶劑對(duì)菌體細(xì)胞的毒性或刺激性較大，生物相容性不好。此外，添加2%的乙酸乙酯，菌體濃度較對(duì)照增加了4%，但是恩拉霉素相對(duì)含量只有對(duì)照組的57.93%，可能是因?yàn)橐宜嵋阴プ鳛橐环N表面活性劑可以減小發(fā)酵液中氣泡的直徑，有利于發(fā)酵液中氧的傳遞，促進(jìn)菌體濃度略微增加，但乙酸乙酯可能不利于恩拉霉合成，故其無法提高恩拉霉素的產(chǎn)量。根據(jù)表1結(jié)果，選擇正十六烷作為最適氧載體開展后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 正十六烷濃度對(duì)恩拉霉素發(fā)酵的影響

根據(jù)1.4.2項(xiàng)中方法，比較添加不同濃度正十六烷對(duì)恩拉霉素發(fā)酵的影響，不同濃度正十六烷體系下得到的菌體濃度和恩拉霉素的相對(duì)含量結(jié)果見圖1。

圖1 正十六烷添加量對(duì)恩拉霉素發(fā)酵的影響Figure 1 Effects of different concentration of n－h(huán)exadecane on fermentation production of enramycin

由圖1可知，與未加入正十六烷的對(duì)照相比較，正十六烷的添加量為0.5%時(shí)，體系的菌體濃度增加了13%，恩拉霉素的相對(duì)含量提高了96.85%。當(dāng)添加量超過1.0%時(shí)，菌體的生長(zhǎng)開始受到抑制，但是對(duì)恩拉霉素合成的促進(jìn)作用依然明顯。當(dāng)添加量達(dá)到4.0%時(shí)，菌體生長(zhǎng)已經(jīng)受到很明顯的抑制，菌體濃度僅較對(duì)照提高了3%，恩拉霉素相對(duì)含量大幅下降，僅高出對(duì)照組31.45%。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，恩拉霉素發(fā)酵過程中添加0.5%正十六烷作為氧載體，可以改善發(fā)酵液中的溶氧情況，較好地促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)及恩拉霉素的合成。

2.3 正十六烷添加時(shí)間對(duì)恩拉霉素發(fā)酵的影響

參照1.4.3項(xiàng)中的方法，在0，2，4，6 d分別添加0.5%正十六烷，比較正十六烷不同添加時(shí)間對(duì)恩拉霉素發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 正十六烷添加時(shí)間對(duì)恩拉霉素發(fā)酵的影響Figure 2 Effects of adding time of n－h(huán)exadecane on fermentation production of enramycin

由圖2可知，在接種后48 h內(nèi)添加0.5%正十六烷，均能提高菌體濃度和恩拉霉素產(chǎn)量，并且在48 h添加的效果最為明顯，其菌體濃度及恩拉霉素含量分別較對(duì)照組提高了9%和76.39%，較0 h添加提高了2%和22.09%。而在接種48 h之后添加0.5%的正十六烷，菌體濃度和恩拉霉素相對(duì)含量逐漸下降，不及48 h添加正十六烷的效果好，說明恩拉霉素生產(chǎn)菌在生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期（48 h）對(duì)氧的需求更強(qiáng)烈，存在著溶解氧的不足，此時(shí)添加氧載體更有利于菌體的生長(zhǎng)和后期恩拉霉素的積累。因此，恩拉霉素發(fā)酵過程中氧載體正十六烷較佳添加時(shí)間是在接種48 h（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期）。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

綜合以上單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用響應(yīng)面法優(yōu)化氧載體正十六烷添加方式。以恩拉霉素含量（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)氧載體正十六烷的添加量（A）和添加時(shí)間（B）這兩個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，響應(yīng)面試驗(yàn)的因素水平見表2，響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平及編碼Table 2 Factors and levels in the central composite experimental design

表3 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Design and results of the response surface methodology

采用Design－Expert軟件進(jìn)行二元回歸擬合，得到恩拉霉素含量為響應(yīng)值的回歸方程：

回歸方程分析見表4，正十六烷的添加量與添加時(shí)間的響應(yīng)面與等高線圖見圖3。

表4 回歸方程的方差分析Table 4 Analysis of variance in regression

由表4可知，B、A2、B2對(duì)Y（恩拉霉素含量）的影響極其顯著。模型方程的F 值為143.15，Prob＞F 的值＜0.000 1，說明模型是極其顯著的，而失擬項(xiàng)的F值為2.34，Prob＞F的值為0.215，說明是不顯著的?；貧w方程相關(guān)系數(shù)R2＝0.980 3，高度顯著，說明響應(yīng)值（恩拉霉素含量）的變化有98.03%來源于所選變量，因此該回歸方程可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，使用該方程進(jìn)行真實(shí)的試驗(yàn)點(diǎn)分析是可靠的。由響應(yīng)面圖（圖3）可知，正十六烷的最優(yōu)添加時(shí)間為44.10 h，最優(yōu)添加量為0.72%，該條件下恩拉霉素理論最高含量為2 964.26 mg／L。

2.5 優(yōu)化參數(shù)驗(yàn)證

在正十六烷最優(yōu)添加方式下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次，結(jié)果表明，在此條件下得到恩拉霉素含量平均值為2 940.65 mg／L，與理論預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差在0.80%，因此采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的二次多項(xiàng)式回歸方程準(zhǔn)確、可靠。實(shí)際測(cè)得生產(chǎn)菌菌體濃度較對(duì)照提高了23%，恩拉霉素含量比對(duì)照組（1 733.51 mg／L）提高了70%。

圖3 正十六烷的響應(yīng)面和等高線圖Figure 3 Response surface and contour lines of nhexadecane

3 結(jié)論

恩拉霉素發(fā)酵生產(chǎn)屬于好氧型發(fā)酵，但是發(fā)酵過程中使用的培養(yǎng)基黏度大、固形物含量高，發(fā)酵過程中菌絲體容易結(jié)團(tuán)，導(dǎo)致發(fā)酵系統(tǒng)的溶氧速率降低。傳統(tǒng)供氧方式通常是采用大通氣量及高速攪拌速率相結(jié)合，但是高機(jī)械強(qiáng)度會(huì)增強(qiáng)剪切力，造成菌絲體的損傷，使菌絲體受損不能正常代謝，生產(chǎn)能力下降，同時(shí)操作成本也會(huì)大幅度增加。因而供氧成為制約恩拉霉素發(fā)酵過程中生物反應(yīng)的重要因素，而氧載體發(fā)酵體系由于具有剪切力小、能耗低、氧傳遞速度快等特點(diǎn)，近年來成為新的研究方向，而氧載體應(yīng)用于恩拉霉素方面的文獻(xiàn)鮮有報(bào)導(dǎo)。

油酸、豆油、正十六烷是常用的氧載體，其鋪展系數(shù)為正值，氧在其中有更高的溶解度，其中氧在正十六烷中的溶解度比其在水中的高8倍［16］。郝冬霞［17］發(fā)現(xiàn)61.6 h添加體積分?jǐn)?shù)為0.123的正十六烷可以提高慶大霉素的生產(chǎn)效價(jià)20%以上。王啟軍［18］在黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)酸性蛋白酶過程中添加油酸作為氧載體能夠促進(jìn)產(chǎn)酶。劉元帥等［19］將體積分?jǐn)?shù)10%的正十六烷添加到紅法夫酵母發(fā)酵培養(yǎng)基中，使紅法夫酵母單位類胡蘿卜素合成能力提高了18%。

本研究首先對(duì)多種有機(jī)溶劑作為氧載體的效果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)并不是所有的氧載體均適用于恩拉霉素的發(fā)酵。其中Toween－80和油酸兩種有機(jī)溶劑對(duì)菌體細(xì)胞的毒性或刺激性較大，生物相容性不好，會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)，進(jìn)而影響恩拉霉素合成；而豆油和正十六烷作為氧載體均可以有效提高生產(chǎn)菌菌體濃度和恩拉霉素產(chǎn)量，但豆油添加量過大，且發(fā)酵結(jié)束后不易分離，生產(chǎn)成本大幅增加，所以選擇正十六烷作為恩拉霉素發(fā)酵中最適添加氧載體。接著對(duì)氧載體正十六烷的添加量和添加時(shí)間進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，結(jié)果顯示在44.10 h添加0.72%的正十六烷可以使生產(chǎn)菌菌體濃度較對(duì)照提高23%，使恩拉霉素產(chǎn)量提高70%。因此，添加正十六烷能加強(qiáng)發(fā)酵液中氧傳遞，提高溶氧水平，從而促進(jìn)菌體生長(zhǎng)及恩拉霉素合成。

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