瘦肉精短期染毒對(duì)小鼠肝腎功能及遺傳毒性的影響

鄭艷艷，李羨筠，謝晶，梁丹玉

(廣西壯族自治區(qū)職業(yè)病防治研究院中毒與毒理研究所，廣西 南寧 530021)

·論著·

瘦肉精短期染毒對(duì)小鼠肝腎功能及遺傳毒性的影響

鄭艷艷，李羨筠，謝晶，梁丹玉

(廣西壯族自治區(qū)職業(yè)病防治研究院中毒與毒理研究所，廣西 南寧 530021)

目的探討瘦肉精短期染毒對(duì)小鼠肝腎功能的影響及遺傳毒性損傷。方法取40只KM小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，雌雄各半，分別飲用含瘦肉精1.26 mg/kg、2.52 mg/kg、12.6 mg/kg的水(劑量組)和不含瘦肉精的水(對(duì)照組)，連續(xù)染毒28 d，觀察染毒過程中小鼠臨床表現(xiàn)，結(jié)束染毒后測定肝腎功能及臟器系數(shù)。另取50只KM小鼠隨機(jī)分成5組，每組10只，雌雄各半，連續(xù)5 d分別以6.3 mg/kg、12.6 mg/kg、25.2 mg/kg三個(gè)劑量瘦肉精經(jīng)口灌胃染毒，陰性對(duì)照組以等量超純水灌胃，陽性對(duì)照以80 mg/kg環(huán)膦酰胺腹腔注射。末次染毒后24 h后處死動(dòng)物，分別應(yīng)用小鼠骨髓染色體畸變?cè)囼?yàn)、小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)、小鼠精原細(xì)胞畸變?cè)囼?yàn)對(duì)瘦肉精的體細(xì)胞及生殖細(xì)胞遺傳毒性作用進(jìn)行研究。結(jié)果28 d短期染毒過程中小鼠出現(xiàn)呼吸加快、煩躁不安、毛發(fā)蓬松及肌肉震顫癥狀，肝功能AST含量逐漸升高，腎功能SUA含量和肝臟系數(shù)與對(duì)照組相比顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。小鼠骨髓染色體畸變?cè)囼?yàn)、骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核、精原細(xì)胞畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果，與陰性對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論本次試驗(yàn)劑量28 d短期染毒瘦肉精對(duì)小鼠的肝腎有一定的損害；經(jīng)小鼠骨髓染色體畸變?cè)囼?yàn)、骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核、精原細(xì)胞畸變?cè)囼?yàn)研究，瘦肉精體細(xì)胞和生殖細(xì)胞的遺傳毒性均為陰性。

瘦肉精；肝腎損害；骨髓染色體；嗜多染紅細(xì)胞微核；精原細(xì)胞

瘦肉精化學(xué)名為鹽酸克倫特羅，是由β2腎上腺受體激動(dòng)劑人工合成，在20世紀(jì)80年代被發(fā)現(xiàn)有顯著促進(jìn)瘦肉增長和減少脂肪的效果，因此曾經(jīng)被作為飼料添加劑大量使用[1]。近年有瘦肉精殘留的食品安全問題發(fā)生，食用含瘦肉精殘留的肉及內(nèi)臟引起許多不適的中毒癥狀，造成多器官、系統(tǒng)的損害，給人類健康帶來危害。筆者試圖通過28 d短期染毒觀察瘦肉精對(duì)小鼠肝腎的短期損害效應(yīng)；進(jìn)行小鼠骨髓染色體畸變?cè)囼?yàn)、小鼠精原細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)、小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)研究瘦肉精對(duì)小鼠體細(xì)胞和生殖細(xì)胞的遺傳毒性損傷。

1 材料與方法

1.1 材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SPF級(jí)KM小鼠，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)：SCXK桂2009-0002)。本實(shí)驗(yàn)室取得廣西壯族自治區(qū)科技廳頒發(fā)的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證》，許可證號(hào)：SYXK桂2009-0003。瘦肉精(鹽酸克倫特羅)對(duì)照品(批號(hào): 100072-200402)由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.128 d短期染毒毒性試驗(yàn)取小鼠40只，體重(18±2)g，按體重隨機(jī)分為4組，每組10只，雌雄各半。根據(jù)瘦肉精急性經(jīng)口LD50(126 mg/kg)確定染毒劑量，分別為1.26 mg/kg、2.52 mg/kg、12.6 mg/kg三個(gè)劑量組。精密稱取瘦肉精對(duì)照品，稀釋成相應(yīng)濃度的飲用水，小鼠自由飲用，連續(xù)28 d。對(duì)照組飲用不含瘦肉精的去離子水。染毒期間觀察動(dòng)物一般臨床表現(xiàn)，每周稱量一次體重。染毒結(jié)束時(shí)摘眼球放取血，用全自動(dòng)生化分析儀測定肝功能包括：天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(ALT)；腎功能包括尿酸(SUA)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)。處死小鼠后取肝、腎臟進(jìn)行稱重，計(jì)算其臟器系數(shù)。

1.2.2 遺傳毒性試驗(yàn)取成年小鼠50只，體重(20±2)g，按體重隨機(jī)分為5組，每組10只，雌雄各半。設(shè)6.3 mg/kg、12.6 mg/kg、25.2 mg/kg三個(gè)劑量組，陽性對(duì)照組(環(huán)膦酰胺，劑量為80 mg/kg)，陰性對(duì)照組(超純水)。試驗(yàn)組經(jīng)口灌胃給藥，亞急性染毒(1次/d，連續(xù)5 d)；陽性對(duì)照組腹腔注射給藥(1次/d，連續(xù)5 d)；陰性對(duì)照組同時(shí)灌胃等量超純水。末次染毒24 h后頸椎脫臼法處死小鼠，處死前4 h按6 mg/kg體重腹腔注射秋水仙素。

1.2.2.1 小鼠骨髓染色體畸變?cè)囼?yàn)[2]取雙側(cè)股骨，用生理鹽水沖取骨髓，低滲法制片。每只動(dòng)物油鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，記錄斷片、微小體、環(huán)狀體等畸變細(xì)胞數(shù)，計(jì)算畸變率。

1.2.2.2 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)[3]取胸骨骨髓涂片，固定后Giemsa染色。每只動(dòng)物計(jì)數(shù)1 000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞，計(jì)算微核率(‰)，同時(shí)計(jì)數(shù)500個(gè)嗜多染紅細(xì)胞的同時(shí)觀察到的正常紅細(xì)胞數(shù)，求出PCE/NCE值。

1.2.2.3 小鼠精原細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)[4]雄性動(dòng)物取雙側(cè)睪丸，去除被膜后剪碎低滲法制片。每只動(dòng)物油鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，記錄斷片、微小體、環(huán)狀體等畸變細(xì)胞數(shù)，計(jì)算畸變率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2進(jìn)行分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.128 d短期染毒毒性效應(yīng)結(jié)果

2.1.1 小鼠一般表現(xiàn)及肝腎臟器系數(shù)染毒前期小鼠進(jìn)食、飲水、活動(dòng)等未見異常。染毒21 d后高劑量組動(dòng)物出現(xiàn)呼吸加快、煩躁不安、毛發(fā)蓬松癥狀，個(gè)別動(dòng)物還出現(xiàn)肌肉震顫癥狀。由表1看出，染毒28 d后各組動(dòng)物體重均增加，且隨劑量增大呈上升趨勢，12.6 mg/kg劑量組動(dòng)物體重明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；12.6 mg/kg劑量組肝臟系數(shù)明顯小于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.1.2 小鼠血清肝腎功能生化指標(biāo)測定隨著染毒劑量的增大，小鼠肝功能指標(biāo)AST呈升高趨勢，其中12.6 mg/kg劑量組明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。12.6 mg/kg劑量組腎功能指標(biāo)SUA明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.2 瘦肉精遺傳毒性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 小鼠骨髓染色體畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果瘦肉精各劑量組小鼠骨髓染色體畸變率與陰性對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。陽性對(duì)照組畸變率顯著高于陰性對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

2.2.2 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果瘦肉精各劑量組的微核率與陰性對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。陽性對(duì)照組微核率高于陰性對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

2.2.3 小鼠睪丸精原細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果陽性對(duì)照組畸變率高于陰性對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，瘦肉精各劑量組小鼠精母細(xì)胞染色體畸變率與陰性對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表5。

表1 瘦肉精對(duì)小鼠體重和肝腎臟器系數(shù)的影響（±s)

表1 瘦肉精對(duì)小鼠體重和肝腎臟器系數(shù)的影響（±s)

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05。

表2 瘦肉精對(duì)小鼠血清生化的影響(±s)

表2 瘦肉精對(duì)小鼠血清生化的影響(±s)

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05。

注：與陰性對(duì)照組比較，aP>0.05，bP<0.05。

表4 瘦肉精小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果(個(gè))

表5 瘦肉精小鼠睪丸精原細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果(個(gè))

3 討論

鹽酸克倫特羅是一種平喘藥，1984年美國研究者發(fā)現(xiàn)其具有明顯提高瘦肉率及減少脂肪率的效果，其后被廣泛應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)中，2002年起中國境內(nèi)禁止在動(dòng)物飲用水及飼料總使用，但有些不良商家為經(jīng)濟(jì)利益，違規(guī)使用瘦肉精，瘦肉精的潛在危害不容忽視。有報(bào)道指出慢性中毒小鼠毛發(fā)、肝腎和肌肉中鹽酸克倫特羅殘留量按濃度大小依次為：毛發(fā)＞肝腎＞肌肉[5]。本研究的28 d短期染毒主要探討肝腎功能的損害，肝臟是機(jī)體的代謝中樞，進(jìn)入體內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)在肝臟中被代謝、轉(zhuǎn)化和處理；腎臟是一個(gè)重要的排泄器官，大部分代謝產(chǎn)物通過腎臟排出體外。研究發(fā)現(xiàn)肝功能中高劑量組天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶結(jié)果明顯高于對(duì)照組而肝臟臟體系數(shù)明顯低于對(duì)照組，提示該劑量下的瘦肉精對(duì)小鼠的肝臟已造成一定的影響。腎功能高劑量組SUA降低，但Cr和BUN變化不明顯。嚴(yán)蕾等[6]對(duì)大鼠灌胃染毒30 d后，血清AST含量及肝、腎臟系數(shù)亦有類似的效應(yīng)。由于該藥在家畜肝、腎中蓄積量較大，人若經(jīng)常食用瘦肉精殘留量高的動(dòng)物內(nèi)臟，易產(chǎn)生慢性中毒反應(yīng)，對(duì)肝臟、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)等都會(huì)產(chǎn)生一定的不良作用，出現(xiàn)肌肉震顫、心慌、戰(zhàn)栗、頭痛、惡心、嘔吐等癥狀，特別對(duì)高血壓、心臟病、甲亢、前列腺肥大等疾病患者危害更大，嚴(yán)重者可致人死亡。本研究在染毒28 d時(shí)體重增加表現(xiàn)出劑量反應(yīng)關(guān)系，高劑量組體重明顯高于對(duì)照組，提示在該劑量作用下，瘦肉精對(duì)機(jī)體物質(zhì)代謝和營養(yǎng)再分配可能有一定的影響，國內(nèi)亦有類似的報(bào)道[7]，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步確證研究。

哺乳動(dòng)物骨髓染色體畸變?cè)囼?yàn)用于檢測受試物誘發(fā)嚙齒類動(dòng)物骨髓染色體結(jié)構(gòu)畸變作用，微核試驗(yàn)通過分析嚙齒類動(dòng)物骨髓中的嗜多染紅細(xì)胞，在染毒動(dòng)物中有微核的嗜多染紅細(xì)胞出現(xiàn)頻率的增加，是引起染色體損傷的指證，這兩項(xiàng)試驗(yàn)均是檢測體細(xì)胞的遺傳損傷。多代精原細(xì)胞對(duì)化學(xué)品染毒后具有廣泛的敏感性各不相同，當(dāng)染毒的精原細(xì)胞變?yōu)榫讣?xì)胞時(shí)，通過對(duì)處于終變期分裂中期Ⅰ相的染色體型畸變進(jìn)行減數(shù)分裂的染色體分析，可從染毒后的精原干細(xì)胞中獲得更多信息。檢測精原細(xì)胞染色單體型畸變，應(yīng)檢查染毒后細(xì)胞的第一次有絲分裂，以免有些損傷在其后的細(xì)胞分裂中丟失，因此本研究采用染毒后24 h采樣。

瘦肉精對(duì)機(jī)體的毒性進(jìn)行了較多的研究，主要集中在近期毒性效應(yīng)比較多，對(duì)其致突變的研究較少，本研究以1/5LD50作為最高染毒劑量連續(xù)5 d對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃染毒以觀察瘦肉精對(duì)骨髓細(xì)胞和生殖細(xì)胞遺傳毒性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在25.2 mg/kg劑量下其畸變率均無顯著增加，表明在本試驗(yàn)劑量下，鹽酸克倫特羅對(duì)體細(xì)胞和生殖細(xì)胞無遺傳作用，這一結(jié)果與國內(nèi)同類研究結(jié)果相一致[8]。這為瘦肉精對(duì)機(jī)體健康影響以及遺傳毒性評(píng)價(jià)提供依據(jù)，但其長期低劑量反復(fù)接觸的遠(yuǎn)期效應(yīng)還需要進(jìn)一步研究。

[1]李羨筠.瘦肉精的毒性和致突變性研究進(jìn)展[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2009,26(4):653-655.

[2]GB/T 21772-2008化學(xué)品哺乳動(dòng)物骨髓染色體畸變?cè)囼?yàn)方法[S].

[3]GB/T 21773-2008化學(xué)品體內(nèi)哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核試驗(yàn)方法[S].

[4]GB/T 21751-2008化學(xué)品哺乳動(dòng)物精原細(xì)胞染色體染色體畸變?cè)囼?yàn)方法[S].

[5]趙晶晶,李云蘭,梁晉瓊,等.鹽酸克倫特羅在小鼠毛發(fā)與肝腎和肌肉中殘留量關(guān)系的研究[J].藥物分析雜志,2009,28(9): 1277-1281.

[6]嚴(yán)蕾,孫高峰,楊浩峰,等.“瘦肉精”危害的實(shí)驗(yàn)研究[J].疾病控制雜志,2005,9(6):596-599.

[7]王恩峰,張霞,龐全海.鹽酸克倫特羅對(duì)小鼠體重及心臟組織形態(tài)學(xué)的影響[J].中國動(dòng)物檢疫,2010,27(8):37-40.

[8]賈強(qiáng),張振玲,王筱芬,等.鹽酸克倫特羅的急性毒性和致突變?cè)囼?yàn)[J].毒理學(xué)雜志,2005,19(2):75-76.

Influence of short-term exposure to Clenbuterol on the hepatic and renal functions and genetic toxicology of mice.

ZHENG Yan-yan,LI Xian-jun,XIE Jing,LIANG Dan-yu.Research Institute of Poisoning and Toxicology,The Occupational Disease Prevention and Control Institute of Guangxi Zhuang Autonomous Region,Nanning 530021, Guangxi,CHINA

ObjectiveTo explore the influence of short-term exposure to clenbuterol on the hepatic and renal functions and genetic toxicology of Mice.Methods40 KM mice were randomly divided into 4 groups.There were 10 mice in each group which were half male and half female.The mice in dose groups were fed with clenbuterol solution of different concentration(1.26 mg/kg,2.52 mg/kg,12.6 mg/kg)respectively and the mice in control group were fed with water.Mice were fed continuously for 28 day in each group.Clinical manifestations were observed during the exposure.Hepatic and renal functions along with organic coefficients were determined after the exposure. Moreover,another 50 KM mice were randomly divided into 5 groups.There were 10 mice in each group which were half male and half female.The mice in dose groups were administered with clenbuterol of different dosage(6.3 mg/kg, 12.6 mg/kg,25.2 mg/kg)respectively by gavage once a day for 5 days.The mice in negative control group were administered with equal volume of ultrapure water by gavage while the mice in positive control group were injected intraperitoneally with 80 mg/kg cyclophosphamidum(CY).Mice were killed 24 hours after the last exposure to determine the genetic toxicology of clenbuterol on somatic cells and germ cells through chromosome aberration test,polychromatic erythrocytes(PCE)of bone marrow cells and SSCS distortion test.ResultsMice had symptoms of breathing rapidly,dysphoria,shaggy and muscle tremors during the process of exposure to clenbuterol for 28 days.The level of AST increased gradually while the level of SUA and liver coefficient of the dose groups were significantly decreased than that of the control group(P<0.05).There were no statistical differences between those dose groups and the control group on the results of chromosome aberration test,polychromatic erythrocytes(PCE)of bone marrow cells and SSCS distortion test(P>0.05).ConclusionIn short-term exposure to clenbuterol for 28 days,the hepatic and renal functions of mice were damaged.The results of chromosome aberration test,polychromatic erythrocytes(PCE)of bone marrow cells and SSCS distortion test showed that clenbuterol has no genetic toxicity to somatic cells and germ cells.

Clenbuterol;Hepatic and runal damage;Bone marrow chromosome;Polychromatic erythrocytes (PCE);Spermatogenium

R-332

A

1003—6350（2014）07—0937—04

2014-02-07)

廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳醫(yī)藥衛(wèi)生科研項(xiàng)目(編號(hào)：Z2007105)

李羨筠。E-mail:Lxjgxnn@126.com