P-VEGFR-3、P-AKT、P-PDGFR-α及D2-40在子宮內(nèi)膜癌中的表達及意義

林春華，唐 蜜，陳 旻，劉 曼，桑 娜

（湖南省婦幼保健院病理科，湖南 長沙 410008）

P-VEGFR-3、P-AKT、P-PDGFR-α及D2-40在子宮內(nèi)膜癌中的表達及意義

林春華，唐 蜜，陳 旻，劉 曼，桑 娜

（湖南省婦幼保健院病理科，湖南 長沙 410008）

目的分析磷酸化的血管內(nèi)皮生長因子受體3(P-VEGFR-3)、磷酸化的蛋白激酶(P-AKT)、磷酸化的血小板源性生長因子α受體(P-PDGFR-α)及淋巴內(nèi)皮標記物D2-40在子宮內(nèi)膜癌、子宮內(nèi)膜不典型增生及子宮內(nèi)膜炎癥性疾病中的蛋白表達差異，以探討其臨床檢測價值。方法對有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌、子宮內(nèi)膜不典型增生及子宮內(nèi)膜炎癥性疾病患者的石蠟組織標本各25例進行免疫組織化學染色，顯微鏡下觀察P-VEGFR-3、P-AKT、P-PDGFR-α及D2-40的陽性表達情況。應用SPSS16.0統(tǒng)計學軟件分析各組之間的差異性，等級資料和率的比較分別采用Riddit分析及Fisher檢驗。結(jié)果有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌組織P-VEGFR-3、P-AKT、P-PDGFR-α及D2-40的陽性表達率和陽性表達程度均明顯高于無淋巴轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌組織，且無淋巴轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌組織P-VEGFR-3、P-AKT、P-PDGFR-α及D2-40的陽性表達率和陽性表達程度均明顯高于子宮內(nèi)膜不典型增生組織，各指標的組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但子宮內(nèi)膜不典型增生和炎癥性疾病組織之間各指標比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。結(jié)論P-VEGFR-3、P-AKT、P-PDGFR-α及D2-40與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關，臨床上可作為其發(fā)病和預后的評估指標。

磷酸化的血小板源性生長因子α受體；磷酸化的血管內(nèi)皮生長因子受體3；磷酸化的蛋白激酶磷酸化的血小板源性生長因子α受體；淋巴內(nèi)皮標記物D2-40；子宮內(nèi)膜癌

子宮內(nèi)膜癌為婦產(chǎn)科臨床最為常見的惡性腫瘤之一。近年來，子宮內(nèi)膜癌的治療研究雖取得了一定進展，但其5年生存率仍無明顯改善。影響其術后生存率的主要因素之一是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[1]，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關的各項分子標記物得到廣大學者的重視，由此開展了以各項標記物為靶點的腫瘤生物療法的研究。血小板源性生長因子α受體(Platelet derived growth factor receptor α，PDGFR-α)、血管內(nèi)皮生長因子受體3(Vascular endothelial growth factor，VEGFR-3)、蛋白激酶(Threonine kinase，AKT)及D2-40為近年腫瘤生物治療研究領域的熱點[2-4]，其中前三者以磷酸化為主要激活形式。各因子在生殖、內(nèi)分泌及消化系腫瘤的研究中均取得了一定進展，但其在子宮內(nèi)膜癌中的研究較為鮮見，國內(nèi)尚處于起步階段。本研究對子宮內(nèi)膜癌、子宮內(nèi)膜不典型增生及子宮內(nèi)膜炎癥性疾病的組織切片進行免疫組化研究，以探討P-VEGFR-3、P-AKT、P-PDGFR-α及D2-40對子宮內(nèi)膜癌的臨床診斷和預后評估價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 石蠟組織標本收集于本院2008年6月至2013年3月收治的子宮內(nèi)膜病變患者，患者均于就診時刮取子宮內(nèi)膜組織，制備石蠟切片。根據(jù)患者的病理情況分為4組：A組為有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌；B組為無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌；C組為子宮內(nèi)膜不典型增生；D組為子宮內(nèi)膜炎性病變；各組均為25例。

1.2 觀察指標 顯微鏡下觀察P-VEGFR-3、P-AKT、P-PDGFR-α及D2-40的陽性表達率和陽性表達程度。

1.3 檢測方法 采用DAKO公司的ELPS法(En-Vision兩步法免疫組化試劑盒)，主要步驟按說明書進行：①常規(guī)脫蠟至水，以PBS沖洗3次×5 min，微波爐中進行抗原修復(中火10 min)，流水自然冷卻后PBS沖洗3次×5 min。②以3.0%的H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，每張切片1滴，室溫孵育10 min，PBS沖洗3次×5 min。③一抗孵育，每張切片滴加一抗稀釋液1滴，室溫孵育150 min，PBS沖洗3次×5 min。④分別滴加試劑A和試劑B，試劑A孵育20 min，試劑B孵育30 min，每次孵育完畢PBS沖洗3次×5 min。⑤配置DBA液，滴于切片，顯微鏡下觀察，確認抗體孵育成功后蘇木素復染，制備中性樹膠封片，電鏡下觀察。一抗Anti-phospho-PDGF Receptor alpha(ab79318；1:500)與Anti-D240(ab77854；1:1000)均由Abcam提供，Anti-phospho-VEGF Receptor 3(CB5793；1:200)由北京清源浩生物科技有限公司提供，Anti-phospho-AKT (SAB4504016，1:1000)由Sigma提供。

1.4 陽性率觀察方法 顯微鏡下可見棕色或棕黃色陽性表達顆粒。每個切片選取3個視野，計數(shù)100個細胞，觀察著色程度和著色比例。著色程度：無色0分；淡黃色1分；棕黃色2分；褐色3分。著色比例：著色細胞數(shù)不足5.0%0分；5.0%～25%1分；26%50%2分；＞50%3分。陽性得分=著色程度×著色比例，根據(jù)陽性得分，分為四個等級，0～1分為陰性，以“-”表示；2～3分為弱陽性，以“+”表示；4～6分為陽性，以“++”表示；＞6分為強陽性，以“+++”表示。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS16.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。所得陽性率均以百分比(%)表示，陽性等級資料采用秩和檢驗，陽性率的比較采用Fisher確切概率法檢驗；以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 P-VEGFR-3的陽性表達 A組患者子宮內(nèi)膜癌組織中的P-VEGFR-3陽性表達率和陽性表達程度均明顯高于B組(P＜0.01或P＜0.05)，B組明顯高于C組(P＜0.01)，C組和D組無明顯差異(P＞0.05)，見表1。

表1 各組患者P-VEGFR-3的陽性表達情況[例（%）]

2.2 P-AKT的陽性表達 A組患者子宮內(nèi)膜癌組織中的P-AKT陽性表達率和陽性表達程度均明顯高于B組(P＜0.05)，B組明顯高于C組(P＜0.05)，C組和D組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表2。

表2 各組患者P-AKT的陽性表達情況[例（%）]

2.3 P-PDGFR-α的陽性表達 A組患者子宮內(nèi)膜癌組織中的P-PDGFR-α陽性表達率和陽性表達程度均明顯高于B組(P＜0.01或P＜0.05)，B組明顯高于C組(P＜0.05)，C組和D組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表3。

表3 各組患者P-PDGFR-α的陽性表達情況[例(%)]

2.4 D2-40的陽性表達 A組患者子宮內(nèi)膜癌組織中的D2-40陽性表達率和陽性表達程度均明顯高于B組(P＜0.01)，B組明顯高于C組(P＜0.05)，C組和D組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表4。

表4 各組患者D2-40的陽性表達情況[例（%）]

3 討論

腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移機制復雜，受多重因素的影響，然而淋巴管的形成為其形態(tài)學基礎，也是供養(yǎng)腫瘤細胞的必要條件。已有研究[5]證實，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是子宮內(nèi)膜癌致死的最主要原因之一，也是婦科臨床亟待解決的重要課題。當前研究背景下，對腫瘤細胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分子生物學研究主要集中于以下幾點：血管內(nèi)皮生長因子C及其受體系統(tǒng)(VEGF-C/VEGFR-3)、表皮生長因子受體系統(tǒng)(EGFR/HER-2)、趨化因子受體及配體系統(tǒng)(CXCR/CCL)、抑瘤基因及金屬基質(zhì)蛋白酶。其中P-VEGFR-3、P-PDGFR-α及P-AKT為與VEGF-C/VEGFR-3和EGFR/HER-2系統(tǒng)密切相關的效應因子，在甲狀腺癌、乳腺癌、原發(fā)性肝癌等多種惡性腫瘤的研究中，均已被證實為異常高表達。部分研究結(jié)果顯示各因子聯(lián)合D2-40檢測對惡性腫瘤的臨床診斷和預后評估具有較高價值，然而其在子宮內(nèi)膜癌中的研究尚為少見[6]。就淋巴細胞的遷移性而言，各類惡性腫瘤具有高度的相似性，本次研究對子宮內(nèi)膜癌患者的P-VEGFR-3、P-AKT、P-PDGFR-α及D2-40表達情況作初步研究，以進一步探討其臨床價值。

VEGF-C是目前為止發(fā)現(xiàn)的最具特異性的淋巴管內(nèi)皮生長刺激因子，其主要受體為VEGFR-2及VEGFR-3[7]。研究已證實，VEGFR-3與VEGF-C結(jié)合后，可通過多條途徑發(fā)生磷酸化，促進淋巴管新生和腫瘤淋巴管轉(zhuǎn)移[8]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌VEGFR-3表達水平顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌，且無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌表達水平顯著高于非典型性增生和炎癥性疾病，證實了VEGFR-3對子宮內(nèi)膜癌的診斷和預后評估價值。

磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶(Phosphatidylinositol3-kinase/serine/threonine kinase，PI3K/AKT)為EGFR/HER-2信號的下游通路，在多種惡性腫瘤中均有活化，主要參與腫瘤細胞的增殖和遷移過程。因P-AKT是AKT的主要活性形式，PI3K/AKT通路的活化又以P-AKT的異常高表達為主要標志。國內(nèi)學者張曉明等[9]對95例子宮內(nèi)膜癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型癌和Ⅱ型癌的P-AKT陽性表達率均為50%左右，而發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者高達89.2%；本研究亦發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌組織P-AKT陽性表達率分別為88.0%、56.0%，與張曉明等[9]研究結(jié)果具有高度的一致性。血小板增多癥一度被認為是伴癌綜合征，血小板包裹腫瘤細胞一方面可使其產(chǎn)生免疫逃逸作用；另一方面還能夠分泌血小板血管通透因子，促進病灶的胞外轉(zhuǎn)移。隨著分子靶向治療的發(fā)展，PDGF在腫瘤的研究中日益受到重視。實質(zhì)上，PDGF是最早發(fā)現(xiàn)的多肽類生長因子之一，與細胞的分裂和增殖密切相關，與其特異性受體結(jié)合后才能發(fā)揮生物學活性。PDGFR-α為其特異性受體之一，在與PDGF結(jié)合后首先發(fā)生自身磷酸化，與具有SH2結(jié)構(gòu)域的底物結(jié)合，包括PI3K，因此P-PDGFR-α亦為PI3K/AKT的重要效應因子之一[10]。本研究發(fā)現(xiàn)P-PDGFR-α在各組之間的表達趨勢與P-AKT基本一致，但有少許差異，主要是由于除PI3K/AKT外，P-PDGFR-α還受其他因素的影響，如多種原癌基因和細胞因子。

D2-40是新近發(fā)現(xiàn)的特異性表達于淋巴管內(nèi)皮細胞標志物，已有研究證實宮頸癌與子宮內(nèi)膜癌的微淋巴管密度預后呈負相關，說明淋巴管密度對子宮內(nèi)膜癌的預后評估具有重要作用[11]。另有部分研究[12]指出D2-40表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度、臨床分期等均呈正相關，對腫瘤系疾病的臨床診斷中具有重要價值。本研究亦發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜疾病中，D2-40與P-VEGFR-3、P-AKT、P-PDGFR-α具有相似的表達趨勢，不僅可用于癌變的診斷，還可應用于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移評估。

綜上所述，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關，P-VEGFR-3、P-AKT、P-PDGFR-α及D2-40均為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要標記物，可作為子宮內(nèi)膜癌的臨床診斷和預后評估指標深入研究。

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Expression and significance of P-VEGFR-3,P-AKT,P-PDGFR-α and D2-40 in endometrial cancer.

LINChun-hua,TANG Mi,CHEN Min,LIU Man,SANG Na.

Department of Pathology,Hunan Maternal and Child Health Hospital,Changsha 410008,Hunan,CHINA

ObjectiveTo analyze the protein expression difference of P-VEGFR-3,P-AKT,P-PDGFR-α and D2-40 in the pathological tissues of endometrial cancer,atypical hyperplasia of endometrium(AHE)and endometrial inflammatory disease(EID),so as to explore their clinical detection value.MethodsThe pathological tissues of endometrial cancer with lymphatic metastasis,endometrial cancer without lymphatic metastasis,AHE and EID(each with 25 samples)were observed under the microscope after immunohistochemistry,and the positive expression of P-VEGFR-3,P-AKT,P-PDGFR-α and D2-40 were detected and analyzed with Riddit,Fisher and SPSS16.0 statistical software.ResultsThe positive expression rate and degree of P-VEGFR-3,P-AKT,P-PDGFR-α and D2-40 in endometrial cancer with lymphatic metastasis were all higher than those in endometrial cancer without lymphatic metastasis;the positive expression rate and degree of P-VEGFR-3,P-AKT,P-PDGFR-α and D2-40 in endometrial cancer without lymphatic metastasis were all higher than those in AHE;and the difference had statistical significance(P＜0.05).But there was no statistically significant difference in positive expression rate and degree of P-VEGFR-3, P-AKT,P-PDGFR-α and D2-40 between AHE and EID(P＞0.05).ConclusionP-VEGFR-3,P-AKT,P-PDGFR-α and D2-40 are closely related to the occurrence of endometrial cancer and lymphatic metastasis,thus could provide evaluation index for clinical diagnosis and prognosis evaluation.

P-PDGFR-α;P-VEGFR-3;P-AKT;D2-40;Endometrial cancer

R737.33

A

1003—6350（2014）24—3634—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.24.1417

2014-08-27)

湖南省衛(wèi)生廳科研基金課題（編號：B2010—083）

林春華。E-mail：1370065571@qq.com