欖香烯誘導裸鼠移植瘤凋亡的作用機制研究*

屠洋洋 俞耀軍 林海鴻 林憲慧 孫維建 盧明東 周 香 余俊華 鄭志強

（溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，浙江 溫州 325000）

欖香烯誘導裸鼠移植瘤凋亡的作用機制研究*

屠洋洋 俞耀軍 林海鴻 林憲慧 孫維建 盧明東 周 香 余俊華 鄭志強△

（溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，浙江 溫州 325000）

目的 觀察欖香烯對裸鼠胃癌移植瘤的作用并探討其相關機制。方法 雄性裸鼠建立人胃癌SCG-7901細胞裸鼠移植瘤模型，隨機分為對照組、欖香烯組、PD98059組、欖香烯和PD98059聯(lián)合組（欖香烯+PD98059組）。對比欖香烯和PD98059對裸鼠胃癌移植瘤的作用，測量對比裸鼠胃癌移植瘤的大小及藥物對裸鼠生長的抑制作用。Western-blot方法檢測各組ERK1/2蛋白、p-ERK1/2、p-P38蛋白的表達情況。結果 3個實驗組在治療后移植瘤大小與對照組比較明顯減小，欖香烯組較對照組p-ERK1/2蛋白表達顯著增多，3個治療組相比對照組p-p38蛋白表達顯著增加，兩藥聯(lián)合比單一藥物作用顯著（均P＜0.05或P＜0.01）。結論 欖香烯和PD98059都能促進腫瘤組織凋亡，其中欖香烯促進裸鼠胃癌移植瘤凋亡可能與p-ERK1/2蛋白和p-p38蛋白上調有關，而PD98059促進裸鼠胃癌移植瘤凋亡可能與p-P38蛋白上調有關。

裸小鼠 移植瘤 欖香烯 PD98059 凋亡

胃癌目前仍以手術治療為主，但非手術治療越來越受研究者關注，特別是中藥在晚期胃癌綜合治療中的作用更是研究熱點。欖香烯是從活血化瘀中藥莪術揮發(fā)油中提取的抗癌有效成分［1］，其主要生物學活性為阻滯細胞周期，誘發(fā)腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞的生長［2］，但具體機制尚未明確，有待進一步探究。本研究觀察欖香烯對裸鼠胃癌移植瘤的作用并探討其相關機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物和細胞株 裸鼠（Balb/cnu/nu）4～6周齡，體質量18～20g，SPF級，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，編號SCXK（滬）2012-0002。人胃腺癌SGC-7901細胞株購自中科院上海細胞生物學研究所。

1.2 藥品和試劑 RPMIl640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；欖香烯注射液（國藥準字H10960114，大連華立金港制藥業(yè)有限公司）；ERK1/2信號通路抑制劑PD98059（美國Sigma公司）；二甲基亞砜（DMSO）（美國Sigma公司）；0.9％氯化鈉注射液（溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院），兔抗人REK1/2及p-REK1/2一抗、兔抗人p-P38、辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔二抗（美國Cell Signaling Technology公司），PrimeScript RT reagent Kit（日本Takara公司），SYBR Green（美國羅氏公司）。

1.3 動物分組、給藥和模型制作 將裸鼠（Balb/cnu/nu）隨機分為4組：對照組、欖香烯組、PD98059組及聯(lián)合組（欖香烯+PD98059組），每組5只。常規(guī)培養(yǎng)SGC-7901細胞，取對數(shù)期生長的細胞，以5×106個/200μL的腫瘤細胞懸液，注射于裸鼠背部，每只0.2mL。3周后，腫瘤可觸及時，開始藥物處理。欖香烯（欖香烯濃度根據(jù)相關文獻結合前期的預實驗）不論是單用藥還是與PD98059聯(lián)合用藥，均使用最大耐受劑量（PD980591mg/kg、欖香烯200mg/kg）；對照組給予0.9％氯化鈉注射液。兩藥聯(lián)合應用時，用藥間隔時間為0.5h。所有藥物每周腹腔注射2次，共5次。

1.4 實驗方法 細胞培養(yǎng)，采用10％胎牛血清、2％的雙抗（青霉素和鏈霉素）的RPMI1640培養(yǎng)基、在37℃、CO2體積分數(shù)為5％、相對濕度95％條件下培養(yǎng)胃癌SGC-7901細胞株，取對數(shù)生長期細胞進行動物實驗。裸鼠處死后，按對照組、PD98059組、欖香烯組、欖香烯+PD98059組分別取心、肺、肝、腎組織標本經(jīng)10％中性甲醛固定后包埋切片，行HE染色，以觀察用藥后各組心、肺、肝、腎組織的病理學改變，了解對比轉移情況。Western-blot法，按對照組、PD98059組、欖香烯組、欖香烯+PD98059組4組移植瘤，通過組織提取出蛋白，并計算出上樣量。制取SDS聚丙烯胺凝膠垂直電泳，轉膜，脫脂牛奶封閉，TBTS洗膜，孵一抗，再TBTS洗膜，孵二抗，再次TBTS洗膜，涂上ECL發(fā)光液，進行曝光，檢測各組ERK1/2、p-ERK1/2和p-P38蛋白的表達情況。RT-PCR法，分別將對照組、PD98059組、欖香烯組和欖香烯+PD98059組的移植瘤剪碎，用勻漿機對4組移植瘤進行研磨，Trizol法提取RNA，溶解于20mL DEPC水，做好標記。進行RNA濃度的測定，確保OD260/OD280在1.8～2.0之間，以說明RNA的純度夠高。通過計算出來的RNA濃度，根據(jù)測出來的RNA濃度進行配平，按Takara逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄，得到cDNA。采用10μL的體系：SYBRGreen5μL、DDH 3μL、上下游引物各0.5μL（capase-3上游引物：5-TGACTGGAAAGCCGAAACTC-3。下游引物：5-GCA AGCCATCTCCTCATCA-3。Bax上游引物：5-ATGCGT CCACCAAGAAGC-3。下游引物：5-CAGTTGAAGTT GCCATCAGC-3。bcl-2上游引物：5-CGACTTCTT CAGCATCAGGA-3。下游引物：5-TGAGCCACAGGGA GGTTCT-3。內參基因β-actin上游引物：5-ATATC GCTGCTGGTCGTC-3。下游引物：5-AGGATGGCGTGA GGGAGAGC-3）、cDNA 1μL。根據(jù)上述體系進行PCR擴增，檢測capase-3、bax、bcl-2 3個凋亡相關基因在3個實驗組和對照組之間的差異，有無統(tǒng)計學意義（實驗組與對照組的差異根據(jù)2-ΔCt法計算）。

1.5 觀察方法 每3～4日測量1次體質量、皮下瘤的大小，包括長徑a和短徑b（mm），并計算皮下瘤的體積，體積（V）＝4/3×π×r3，r=（a+b）/4。停藥解剖剝離腫瘤，稱瘤重及體質量，計算抑瘤率，同時取各組裸鼠心、肺、肝、腎組織。根據(jù)瘤細胞接種的天數(shù)和移植瘤的體積繪制腫瘤的生長曲線。繪制腫瘤生長曲線——瘤細胞接種天數(shù)-移植瘤體積關系。計算抑瘤率（IR），IR=（1-治療組瘤重/對照組腫瘤瘤重）×100％。無明顯腫瘤或雖有小的殘余結節(jié)但是顯微鏡檢查未發(fā)現(xiàn)有腫瘤細胞的裸鼠被認為是完全治愈（CR）。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件。裸鼠的移植瘤體積以（±s）表示，進行方差齊性檢驗后分別成組t檢驗和t’檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 藥物對裸鼠體質量增長的作用 見表1。對照組裸鼠的體質量相比2周前的體質量增加顯著（P＜0.01），PD98059組裸鼠的體質量相比2周前的體質量無顯著變化（P＞0.30），欖香烯組裸鼠給藥2周后體質量增加顯著（P＜0.03），欖香烯+PD98059組注射藥物后的裸鼠與2周前體質量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.40）。

表1 藥物對人胃腺癌裸鼠體質量的影響（±s）

表1 藥物對人胃腺癌裸鼠體質量的影響（±s）

與治療前比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

劑量（mg/kg） 體質量增加（g）等體積的生理鹽水 1.76 1mg/kg 0.82體質量（g）始末20.64±1.016322.40±0.7382*20.50±1.2903 21.32±1.3700組別 n對照組 5 PD98059組 5 200mg/kg 1.56 20.66±1.001422.22±0.8348*欖香烯組 5欖香烯+PD98059組 5 200mg/kg+1mg/kg 20.36±1.1653 21.02±1.2397 0.66

圖1 對照組、PD98059組、欖香烯組、欖香烯+PD98059組裸鼠移植瘤在21～33d之間體積的大小

2.2 藥物對移植瘤生長的影響 見圖1和表2。對照組裸鼠移植瘤體積從21～33d增長顯著；PD98059組裸鼠移植瘤體積相比對照組增長稍緩慢；欖香烯組裸鼠移植瘤的體積增長被抑制，且有減小的趨勢；聯(lián)合組與對照組比較，移植瘤的體積有縮小的趨勢，對移植瘤的生長的抑制作用較欖香烯組更為顯著。

圖2 腫瘤細胞處理3周后拍攝的裸鼠移植瘤

表2 4組移植瘤在21～33d之間的體積（cm3）

2.3 藥物對胃癌移植瘤的治療作用 根據(jù)抑瘤率的計算公式，PD98059組抑瘤率為38.15％，欖香烯組抑瘤率為56.72％，欖香烯+PD98059組抑瘤率為75.59％。分析PD98059組與對照組相比，抑瘤作用不明顯（P＞0.05），欖香烯組抑瘤作用明顯；對照組、PD98059組、欖香烯組、欖香烯+PD98059組的瘤重分別為（0.7890±0.3150）g、（0.4880±0.1314）g、（0.3414±0.2187）g、（0.1898±0.0885）g，瘤重差異顯著（P＜0.05）；欖香烯+PD98059組抑瘤率最高，抑制作用最為顯著（P＜0.01）。

2.4 形態(tài)學檢測結果 見圖3。將4組動物處死后，取下各組的肝腎心肺組織，用10％的多聚甲醛固定，做石蠟切片，行HE染色，每組動物每種器官組織各切片20張，以觀察動物腫瘤細胞的轉移情況，并未發(fā)現(xiàn)癌細胞。

圖3 肝腎心肺組織HE染色（×100倍）

2.5 藥物對ERK1/2蛋白表達的影響 見圖4。對照組、PD98059組、欖香烯組、欖香烯+PD98059組這4組總ERK1/2蛋白的表達依次為（2.2351±1.6828）、（2.0433±1.4598）、（2.2494±1.7144）、（2.2956±1.7546）。兩兩比較，差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

圖4 對照組、PD98059組、欖香烯組、欖香烯+PD98059組裸鼠移植瘤的ERK1/2蛋白表達情況

2.6 藥物對p-ERK1/2蛋白表達的影響 見圖5。對照組、PD98059組、欖香烯組、欖香烯+PD98059組p-ERK1/2蛋白表達依次為（0.1599±0.0320）、（0.1089±0.0652）、（0.3090±0.0934）、（0.1635±0.0230），PD98059組與對照組相比，p-ERK1/2蛋白表達顯著降低（P＜0.05）；與對照組比較，欖香烯組p-ERK1/2蛋白表達增加（P＜0.01）；而欖香烯+PD98059組與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖5 對照組、PD98059組、欖香烯組、欖香烯+PD98059組裸鼠移植瘤的p-ERK1/2蛋白表達情況

2.7 藥物對p-P38蛋白表達的影響 見圖6。對照組、PD98059組、欖香烯組、欖香烯+PD98059組p-P38蛋白表達依次為（0.2044±0.0808）、（0.4078±0.1972）、（0.4227±0.0357）、（0.7922±0.0527）。3個實驗組與對照組相比，p-P38蛋白表達顯著增加（P＜0.01）；而欖香烯+PD98059組與單藥組相比較，p-P38蛋白的表達增加更加顯著（P＜0.01）；PD98059組與欖香烯組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖6 對照組、PD98059組、欖香烯組、欖香烯+PD98059組裸鼠移植瘤的p-P38蛋白表達情況

2.8 運用PCR檢測4個不同動物組的Bax、Bcl-2、Caspase-3基因的表達情況 見表3。對照組、PD98059組、欖香烯組、欖香烯+PD98059組Bax基因的表達呈遞增，兩兩比較差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；Bcl-2基因則是呈遞減的趨勢，兩兩比較差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；而Caspase-3也呈遞增趨勢，兩兩比較差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

表3 不同動物組移植瘤之間的Bax、Bcl-2及Caspase-3 mRNA的表達（±s）

表3 不同動物組移植瘤之間的Bax、Bcl-2及Caspase-3 mRNA的表達（±s）

各組之間根據(jù)2-ΔCt值進行比較，P＜0.01。

組別Bax Bcl-2 Caspase-3 ΔCt 2-ΔCt ΔCt 2-ΔCt ΔCt 2-ΔCt對照組 -0.8360±0.050 1.7866±0.0630.1733±0.045 0.8870±0.028 -0.9366±0.035 1.9144±0.046 PD98059組 -1.0500±0.050 2.0713±0.0720.5066±0.050 0.7041±0.024 -1.2600±0.040 2.3955±0.066欖香烯組 -1.2533±0.055 2.3850±0.0910.9333±0.042 0.5237±0.015 -1.4766±0.065 2.7849±0.125聯(lián)合組 -1.6500±0.026 3.0966±0.1191.5833±0.049 0.3338±0.011 -1.8566±0.047 3.6230±0.119

3 討論

目前認為中藥抗腫瘤主要通過誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖，影響腫瘤細胞蛋白質、核酸的合成，阻滯腫瘤細胞的分裂周期，抑制拓撲異構酶和端粒酶的活性等幾個方面發(fā)揮抗腫瘤作用［3］。

絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）廣泛地存在于各種細胞中，在信號傳導過程中起著重要的作用［4］，主要調控細胞周期的運行和基因表達。研究顯示欖香烯通過MAPK信號通道起作用，但具體通過MAPK中哪條通道起作用，還有待研究［5-8］；Liu等研究發(fā)現(xiàn)欖香烯通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路，從而抑制腫瘤細胞增殖，促進其的凋亡［9］。所以我們構建裸鼠移植瘤模型，通過腫瘤生長曲線的繪制和抑瘤率計算發(fā)現(xiàn)3個藥物組裸鼠的皮下瘤相對對照組都一定的抑制作用，且兩藥聯(lián)合組抑制作用最顯著。通過測量體質量發(fā)現(xiàn)欖香烯組與對照組對裸鼠的體質量生長差異不大，而PD98059組、欖香烯+PD98059組和對照組的裸鼠體質量生長差異顯著，且這兩組裸鼠體質量增長緩慢，說明是PD98059對裸鼠的生長有一定的影響，而欖香烯這種中成藥對裸鼠的生長的影響很小，所以設想欖香烯對人體的生長代謝影響也會很小，為臨床治療腫瘤提供一種新思路。通過對裸鼠的心肺肝腎做大量的石蠟切片，HE染色觀察其病理變化，發(fā)現(xiàn)4組裸鼠的心肺肝腎組織切片差異不大，并未找到瘤細胞轉移，可能未切到有瘤細胞轉移的組織或者瘤細胞轉移的很少，基本上不轉移，推斷皮下移植瘤細胞轉移到肝腎心肺器官的可能比較小。本研究發(fā)現(xiàn)4組裸鼠總ERK1/2蛋白表達差異不顯著，欖香烯組與對照組相比p-ERK1/2蛋白表達增加，說明欖香烯是通過ERK1/2蛋白的磷酸化抑制移植瘤的增殖。PD98059組較對照組p-ERK1/2蛋白表達降低與Kalous J相符［10］，認為PD98059可以抑制ERK1/2蛋白的磷酸化，欖香烯+PD98059組與對照組相比p-ERK1/2蛋白表達增加不顯著，說明PD98059對ERK1/2的作用恰好與欖香烯相反，抑制ERK1/2蛋白的磷酸化，這結果與PD98059是ERK1/2的特異性阻滯劑恰恰相符。PD98059組、欖香烯組、欖香烯+PD98059組相較對照組p-P38蛋白表達增加，而且欖香烯+PD98059組p-P38蛋白表達增加較PD98059組和欖香烯組兩組更為顯著，說明無論欖香烯或PD98059都可以促進P38蛋白的磷酸化且欖香烯和PD98059上調p-P38蛋白表達作用可以疊加，與研究相符合［11-12］。

Caspase家族和bcl-2家族是調節(jié)凋亡發(fā)生的兩大關鍵家族，caspase-3基因是最重要的凋亡執(zhí)行之一，抑制caspase-3可以保護或者降低細胞的凋亡，激活capase-3可以導致凋亡增加［13］，bcl-2為凋亡抑制基因，bax為促凋亡基因［14］。通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，按對照組、PD組、欖香烯組、聯(lián)合組順序，bax基因和caspase-3基因都呈遞增趨勢，而bcl-2基因卻呈遞減趨勢，研究表明欖香烯可以通過上調p-ERK1/2蛋白和p-P38蛋白的表達，從而促進bax基因和caspase-3基因表達增加以及bcl-2基因表達降低抑制移植瘤的增殖和誘導移植瘤的凋亡，PD98059可以抑制ERK1/2蛋白的磷酸化和上調p-P38蛋白的表達，上調bax基因和caspase-3基因及下調bcl-2基因，與誘導移植瘤的凋亡有關，與相關文獻一致［15-16］。

綜上所述，欖香烯可以抑制腫瘤組織的生長及誘導其凋亡，其作用機制可能是通過激活p-ERK1/2和p-P38兩種信號通路；而PD98059也可以抑制腫瘤組織的生長及誘導其凋亡，作用機制可能是通過激活P38信號通路誘導凋亡，但具體p-ERK1/2和p-P38兩種通道在抑制腫瘤組織的生長及凋亡方面有何種作用和聯(lián)系尚未清楚，有待進一步的研究和考證。

［1］Guo HQ，Zhang GN，Wang YJ，et al.beta-Elemene，a compound derived from Rhizoma zedoariae，reverses multidrug resistance mediated by the ABCB1 transporter［J］.Oncol Rep，2014，31（2）：858-866.

［2］Lu JJ，Dang YY，Huang M，et al.Anti-cancer properties of terpenoids isolated from Rhizoma Curcumae-a review［J］.J Ethnopharmacol，2012，143（2）：406-411.

［3］鄭起.中藥抗腫瘤作用及其作用機制研究進展［J］.醫(yī)學綜述，2010，16（3）：386-389.

［4］Chai W，Zhang J，Duan Y，et al.Pseudomonas pyocyanin stimulates IL-8 expression through MAPK and NF-kappaB pathways in differentiated U937 cells［J］.BMC Microbiol，2014，14（1）：26.

［5］Yao YQ，Ding X，Jia YC，et al.Anti-tumor effect of beta-el-emene in glioblastoma cells depends on p38 MAPK activation［J］.Cancer Lett，2008，264（1）：127-134.

［6］Yao YQ，Xu YH，Lu J，et al.Effect of p38 MAPK on elemeneinduced cell cycle arrest in C6 glioblastoma cells［J］.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2008，88（1）：56-58.

［7］鄭志強.欖香烯對胃癌細胞p38絲裂原活化蛋白激酶信號通路的影響［J］.中華普通外科雜志，2010，（2）：130-133.

［8］Li L，Xu L，Qu X，et al.Cbl-regulated Akt and ERK signals are involved in beta-elemene-induced cell apoptosis in lung cancer cells［J］.Mol Med Rep，2011，4（6）：1243-1246.

［9］Liu J，Hu XJ，Jin B，et al.beta-Elemene induces apoptosis as well as protective autophagy in human non-small-cell lung cancer A549 cells［J］.J Pharm Pharmacol，2012，64（1）：146-153.

［10］Kalous J，Kubelka M，Motlik J.The effect of PD98059 on MAPK regulation in cumulus-enclosed and cumulus-free mouse oocytes［J］.Zygote（Cambridge，England），2003，11（1）：61-68.

［11］Al-Shanti N，Stewart CE.PD98059 enhances C2 myoblast differentiation through p38 MAPK activation：a novel role for PD98059［J］.J Endocrinol，2008，198（1）：243-252.

［12］Hotokezaka H，Sakai E，Kanaoka K，et al.U0126 and PD98059，specific inhibitors of MEK，accelerate differentiation of RAW264.7 cells into osteoclast-like cells［J］.J Biol Chem，2002，277（49）：47366-47372.

［13］Shakibaei M，Schulze-Tanzil G，de Souza P，et al.Inhibition of mitogen-activated protein kinase kinase induces apoptosis of human chondrocytes［J］.J Biol Chem，2001，276（16）：13289-13294.

［14］Murphy KM，Ranganathan V，F(xiàn)arnsworth ML，et al.Bcl-2 inhibits Bax translocation from cytosol to mitochondria during drug-induced apoptosis of human tumor cells［J］.Cell Death Differ，2000，7（1）：102-111.

［15］Kong D，Zheng T，Zhang M，et al.Static mechanical stress induces apoptosis in rat endplate chondrocytes through MAPK and mitochondria-dependent caspase activation signaling pathways［J］.PLoS One，2013，8（7）：e69403.

［16］Racz B，Reglodi D，F(xiàn)odor B，et al.Hyperosmotic stress-induced apoptotic signaling pathways in chondrocytes［J］.Bone，2007，40（6）：1536-1543.

The Mechanism of Elemene Inducing Apoptosis of Nude Mice Transplanted Tumor

TU Yangyang，YU Yaojun，LIN Haihong，et al.
The Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Zhejiang，Wenzhou 325000，China

Objective：To observe the effect of elemene inducing nude mice transplanted tumor and to explore the relative mechanism.Method：male nude mice were chosen to establish SCG-7901 gastric transplanted tumor model and were divided into four groups：control group，elemene group（maximum tolerated dose of 200mg/kg），PD98059 group（maximum tolerated dose 1mg/kg），elemene and PD98059 joint group.The effect of elemene and PD98059 on nude mice gastric transplanted tumor were compared，and the size of transplanted tumor were measured and the inhibitive effect on the growth of nude mice were determined.ERK1/2，P-ERK1/2 and P-P38 protein expressions of each group were detected by Western blot method.Result：The size of nude mice transplanted tumors of three experimental groups significantly decreased after treatment compared with control group.And PERK1/2 protein expression of elemene group was more obvious than that of the control group.P-P38 protein expression of three treatment groups increased much more significantly than that of the control group.Elemene and PD98059 combined treatment group had more obvious effect than single drug group.Conclusion：Both elemene and PD98059 can promote tumor tissue apoptosis.Elemene promoting nude mice gastric transplanted tumor apoptosis may be related to increased P-ERK1/2 protein and P-P38 protein，while PD98059 promoting such apoptosis may be related to increased P-P38 protein.

Nude mice；Transplanted tumor；Elemene；PD98059；Apoptosis

R285.5

A

1004-745X（2014）10-1801-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.10.011

2014-07-06）

浙江省衛(wèi)生廳科研基金資助項目（2011KYA112）

△通信作者