牡荊苷對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的影響

周晨慧，張 雪，徐道華

（廣東醫(yī)學(xué)院，廣東 東莞 523808）

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是一種易于擴(kuò)增、具有多種分化潛能的細(xì)胞，在體內(nèi)外特定的條件下，可分化為骨、軟骨、脂肪和肌腱等多種組織細(xì)胞。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，MSCs與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，各種類型的骨質(zhì)疏松癥患者骨髓中的脂肪細(xì)胞與松質(zhì)骨的骨量成反比，骨量的減少與骨髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞增多總是相伴出現(xiàn)。MSCs向成脂細(xì)胞分化作用增強(qiáng)是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的原因之一[1-2]。因此，通過(guò)抑制MSCs向成脂方向分化已成為骨質(zhì)疏松癥防治的研究靶點(diǎn)之一。牡荊苷（vitexin）是自然界中最常見的黃酮碳苷，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、降血糖和神經(jīng)保護(hù)等作用[3-4]。通絡(luò)生骨膠囊對(duì)股骨頭壞死療效極好，對(duì)骨質(zhì)疏松癥也有較好的防治作用，牡荊苷為其主要成分[5]。研究表明，牡荊苷可抑制脂肪細(xì)胞3T3-L1細(xì)胞株向脂肪細(xì)胞分化[6-7]。但牡荊苷是否對(duì)MSCs成脂分化具有抑制作用尚未見報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

牡荊苷（由本實(shí)驗(yàn)室自制，純度大于98%），制備方法見文獻(xiàn)[7]；MTT及 DMSO、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、胰島素、吲哚美辛和地塞米松（均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（均購(gòu)自Gibco公司）；所有引物由Invitrogen公司合成。

1.2 MSCs分離培養(yǎng)

1月齡SPF級(jí)SD大鼠，由廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重（91.5 ± 5.7）g，動(dòng)物合格證編號(hào) SYXK(粵)2008-0007。飼料、飲水和墊料均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。采用全骨髓法分離，無(wú)菌條件下取出雙側(cè)股骨，除去肌肉，切除股骨兩端，沖出骨髓并懸浮于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置37℃及5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，首次24 h換液，以后每3 d換液1次，細(xì)胞達(dá)80%融合時(shí)，0.25% 胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。

1.3 試驗(yàn)分組

分為空白組及試驗(yàn)組?？瞻捉M為MSCs達(dá)80%融合，開始加入分化誘導(dǎo)液，其組成為內(nèi)含0.5 mmol/L 3-異丁基 -1-甲基黃嘌呤、10 g/L 胰島素、0.2 mmol/L 吲哚美辛、1 μmol/L 地塞米松和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。試驗(yàn)組則為MSCs達(dá)80% 融合，開始加入分化誘導(dǎo)液及 10 μmol/L 或 50 μmol/L 的牡荊苷。

1.4 細(xì)胞生存率檢測(cè)

MSCs細(xì)胞以5×103/孔接種于96孔培養(yǎng)板，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞生存率。各組細(xì)胞培養(yǎng)3 d后，加入MTT使其最終質(zhì)量濃度為0.5 g/L，繼續(xù) 37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 4 h，棄培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO，振搖10 min，使甲瓚顆粒完全溶解，采用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。

1.5 油紅O染色檢測(cè)細(xì)胞成脂分化

細(xì)胞誘導(dǎo)分化結(jié)束后，用PBS沖洗細(xì)胞1次，10%甲醛室溫固定30 min，5 g/L的油紅異丙醇溶液用去離子水按3∶2稀釋后加入已固定好的細(xì)胞中，37℃孵育20 min，PBS清洗1次，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR ）和 CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白 （C /EBP ）mRNA 的表達(dá)[8]

收集各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，取1 μg總 RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取1 μg cDNA產(chǎn)物，加入熒光混合物和各基因上、下游引物（引物序列 PPARγ：5′-GAGCATGGTGCCTTCGCTGA-3′和5′-AGCAAGGCACTTCTGAAACCGA-3′；C /EBPα：5′-AAGGCCAAGAAGTCGGTGGA-3′和 5′-CAGTTCGCGGCTCAGCTGTT-3′; β -actin：5′-CGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3′和 5′-CGGACTCATCGTACTCCTGCT-3′，總體積 15 μL。PCR 擴(kuò)增條件為 95℃ 5 min，以后 95℃ 15 s，60℃ 60 s循環(huán) 40次。以 βactin作為內(nèi)參照，目的基因的表達(dá)用相對(duì)表達(dá)量表示。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 對(duì)細(xì)胞生存率的影響

牡荊苷濃度在 1～50 μmol/L范圍內(nèi)對(duì) MSCs生存率無(wú)顯著影響，表明在此濃度下牡荊苷對(duì)MSCs無(wú)顯著毒性，見表1。

表1 牡荊苷對(duì)MSCs生存率的影響

2.2 對(duì)MSCs成脂分化的影響

采用油紅O染色檢測(cè)牡荊苷對(duì)MSCs成脂分化的作用，結(jié)果表明，牡荊苷抑制MSCs成脂分化，且具有劑量依賴性，見圖1。

圖1 牡荊苷對(duì)MSCs成脂分化的影響

2.3 對(duì) PPAR 與 EBP mRNA表達(dá)的影響結(jié)果見表2。

表2 牡荊苷對(duì)PPAR 與EBP mRNA表達(dá)的影響

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量減少、骨的微觀結(jié)構(gòu)退化為特征，致使骨的脆性增加易于發(fā)生骨折的全身性骨骼疾病。骨質(zhì)疏松癥及其所引起的骨折已成為嚴(yán)重危害人類健康的世界性公共衛(wèi)生問(wèn)題。研究表明，骨組織中成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的功能失衡是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的主要病因，目前臨床最常用的治療骨質(zhì)疏松癥藥物主要有雙磷酸鹽類等破骨細(xì)胞抑制藥，這些藥物雖然對(duì)骨質(zhì)疏松癥有一定療效，但存在不良反應(yīng)大、患者不能長(zhǎng)期耐受等缺點(diǎn)[9-10]。

近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，MSCs與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，MSCs成脂分化增強(qiáng)及成骨分化下降，是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的主要原因之一[1-2]。Dalle Carbonare等[2]的研究發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松癥患者外周血中的MSCs成骨分化能力顯著下降。Pino等[1]的研究也發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者M(jìn)SCs成脂分化作用增強(qiáng)，成骨分化作用下降[1]。因此，通過(guò)抑制MSCs向成脂方向分化而促進(jìn)其向成骨方向分化將為骨質(zhì)疏松癥的防治提供新方向[11-13]。本試驗(yàn)首先觀察了牡荊苷對(duì)MSCs毒性的影響，結(jié)果顯示牡荊苷濃度在1～50 μmol/L范圍內(nèi)對(duì) MSCs細(xì)胞無(wú)顯著毒性。此外，本試驗(yàn)進(jìn)一步觀察了牡荊苷對(duì)MSCs成脂分化的作用，結(jié)果表明，牡荊苷可抑制MSCs成脂分化。

目前已鑒定出的對(duì)脂肪細(xì)胞分化有直接影響的轉(zhuǎn)錄因子主要有PPARγ和 C/EBPs[14]。C/EBPs主要有 3種同分異構(gòu)體，即C /EBPα、C /EBPβ 和 C /EBPδ。C /EBPβ 和 C /EBPδ 在 分 化癥的早期被誘導(dǎo)表達(dá)，而C/EBPα是在分化的較晚期階段才表達(dá)。C/EBPα一旦表達(dá)，隨即有大量的脂肪細(xì)胞分化的特異基因開始表達(dá)，C/EBPα的過(guò)表達(dá)可加速3T3-L1前脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化[15]。當(dāng) PPARγ 活化時(shí)，MSCs向成脂方向分化[16]。PPARγ的過(guò)表達(dá)可促使成纖維細(xì)胞系向成脂轉(zhuǎn)化。PPARγ缺陷鼠的胚胎干細(xì)胞無(wú)成脂分化能力，同型PPARγ缺陷小鼠的骨量較野生型小鼠骨量增加[17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，牡荊苷顯著抑制PPARγ和C/EBPα基因表達(dá)，說(shuō)明牡荊苷抑制MSCs成脂分化的機(jī)制可能與其抑制PPARγ和C/EBPα基因表達(dá)有關(guān)。

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