苯酚－硫酸法測(cè)定南瓜籽多糖含量的條件優(yōu)化

池 源 王麗波

CHI YuanWANG Li－bo

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

（College of Science，Northeast Agricultural University，Harbin，Heilongjiang 150030，China）

南瓜 （cucurbita moschata Duch），別名番瓜、飯瓜等，是葫蘆科一年生草本植物。南瓜籽為南瓜的成熟種子，含有豐富的不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)、植物甾醇、維生素、多糖及礦物質(zhì)等［1，2］。目前市場(chǎng)上已出現(xiàn)的一些南瓜籽提取物保健產(chǎn)品［3］，均含有一定多糖成分，并標(biāo)注具有降血糖等生物活性。但未見有關(guān)南瓜籽中多糖含量及其生物活性的相關(guān)報(bào)道。南瓜籽多糖是否與南瓜果肉多糖一樣具有抗氧化及降血糖的功能［4－6］還有待進(jìn)一步研究。

目前多糖含量的測(cè)定方法常用的主要有蒽酮－硫酸法和苯酚－硫酸法兩種。兩種方法顯色原理基本相同，都是在濃硫酸的作用下將多糖水解成單糖，并迅速脫水生成糠醛衍生物，其與蒽酮反應(yīng)可生成藍(lán)綠色糠醛衍生物，或與苯酚生成橙黃色化合物，但相比較苯酚－硫酸法具有試驗(yàn)操作步驟少，穩(wěn)定性好及所用儀器簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)被廣泛用于測(cè)定多糖含量［7－9］中。目前，尚未查到有關(guān)使用苯酚－硫酸法測(cè)定南瓜籽中多糖含量的報(bào)道。因?yàn)楸椒樱蛩岱ū旧泶嬖谝欢ú▌?dòng)性，不同的含糖物質(zhì)測(cè)定條件均有所不同等特點(diǎn)［10，11］，如果只參考已有文獻(xiàn)的測(cè)定條件來(lái)確定具體的試驗(yàn)參數(shù)將可能造成較大的誤差，為提高南瓜籽多糖含量測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究擬采用苯酚－硫酸法測(cè)定南瓜籽中多糖含量，通過優(yōu)化濃硫酸用量、苯酚用量、顯色溫度和顯色時(shí)間等試驗(yàn)條件，并對(duì)精密度、加標(biāo)回收率等進(jìn)行研究，旨在尋求南瓜籽多糖含量的最佳測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

寶庫(kù)1號(hào)裸仁南瓜籽：訥河市寶庫(kù)良種繁育研究所；

濃硫酸：哈爾濱理工化學(xué)試劑有限公司；

苯酚：天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠；

葡萄糖：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司；

雙光束紫外可見分光光度計(jì)：UV－1901型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

可見分光光度計(jì)：WFJ7200型，尤尼科上海儀器有限公司；

電子恒溫不銹鋼水浴鍋：HHS－2S型，上海必爾得實(shí)業(yè)有限公司；

循環(huán)水式多用真空泵：SHB－III型，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；

低速離心機(jī)：SC－3610型，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 南瓜籽粗多糖的制備 取南瓜籽，干燥后用萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎，以無(wú)水乙醚為提取劑，采用索氏提取器脫脂，脫完脂后的南瓜籽干粉呈白色。準(zhǔn)確稱取7.0 g南瓜籽干粉，加入140 m L的蒸餾水，50℃水浴提取1 h，浸提液5 000 r／min離心20 min，上清液濃縮后加入無(wú)水乙醇，至80%的乙醇濃度，靜置過夜，沉淀冷凍干燥，得南瓜籽粗多糖1.1 g。精密稱取一定量南瓜籽粗多糖配制成濃度為0.20 mg／m L的南瓜籽多糖溶液。置于冰箱中冷藏備用。

1.2.2 最大吸收波長(zhǎng)的確定 分別吸取南瓜籽多糖溶液和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液各2.0 m L于25 m L具塞試管中，分別加入6%苯酚溶液1.0 m L，搖勻后迅速加入5.0 m L濃硫酸，30℃水浴30 min，以相應(yīng)試劑空白為參比，采用紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行掃描，波長(zhǎng)范圍為400～600 nm，確定其最大吸收波長(zhǎng)。

1.2.3 濃硫酸用量的確定 吸取2.0 m L南瓜籽多糖溶液于25 m L具塞試管中，加入6%苯酚溶液1.0 m L，搖勻后分別迅速加入濃硫酸4.0，5.0，6.0，7.0，8.0 m L，搖勻，30℃水浴30 min，測(cè)其吸光度值。平行測(cè)定3次。

1.2.4 6%苯酚溶液用量的確定 吸取2.0 m L南瓜籽多糖溶液于25 m L具塞試管中，分別加入6%苯酚溶液0.2，0.6，1.0，1.4，1.8 m L，搖勻后迅速加入5.0 m L濃硫酸，搖勻，30℃水浴30 min，測(cè)定吸光度值。平行測(cè)定3次。

1.2.5 顯色溫度的確定 吸取2.0 m L南瓜籽多糖溶液于25 m L具塞試管中，加入由1.2.4確定的苯酚溶液，搖勻后迅速加入5.0 m L濃硫酸，搖勻分別在0，25，30，50，100℃水浴條件下放置30 min，測(cè)定吸光度。平行測(cè)定3次。

1.2.6 顯色時(shí)間的確定 吸取2.0 m L南瓜籽多糖溶液于25 m L具塞試管中，加入1.0 m L苯酚溶液，搖勻后迅速加入5.0 m L濃硫酸，搖勻于30℃水浴分別處理10，20，30，40，60 min，測(cè)定吸光度值。平行測(cè)定3次。

1.2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取干燥的葡萄糖0.025 1 g于250 m L容量瓶中，加水至刻度，配制成0.100 4 mg／m L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，2.0 m L于25 m L具塞試管中，各以水補(bǔ)至2.0 m L，加入1.0 m L苯酚溶液，搖勻后迅速加入5.0 m L濃硫酸，30℃水浴30 min，測(cè)定吸光度。空白對(duì)照以蒸餾水代替糖溶液。

1.2.8 換算因子的計(jì)算 精密稱取南瓜籽多糖10.0 mg，加蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至50 m L容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，得南瓜籽多糖貯備液。取2.0 m L南瓜籽多糖溶液，按照1.2.7中測(cè)定條件測(cè)定吸光度，由回歸方程計(jì)算出溶液中葡萄糖含量，按文獻(xiàn)［12］的方法檢測(cè)換算因子，其計(jì)算公式見式（1）。

式中：

f—— 換算因子；

W—— 多糖質(zhì)量，mg；

C——多糖溶液中葡萄糖濃度，mg／m L；

D——多糖的稀釋因子。

1.2.9 精密度試驗(yàn) 取上述南瓜籽多糖溶液樣品按1.2.7中測(cè)定條件平行5次測(cè)定，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，并分析其重現(xiàn)性。

1.2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按1.2.7中測(cè)定條件每隔10 min測(cè)定南瓜籽多糖溶液吸光度，1 h后每隔20 min測(cè)定一次，考查2 h內(nèi)的穩(wěn)定性。

1.2.11 加標(biāo)回收率試驗(yàn) 分別吸取南瓜籽多糖溶液2.0 m L 3份于25 m L具塞試管中，按方法1.2.7測(cè)定吸光度值，由吸光度值平均值計(jì)算得南瓜籽多糖含量（以葡萄糖計(jì)）。另取3份南瓜籽多糖溶液1.0 m L于25 m L具塞試管中，分別加入1.0 m L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液按方法1.2.7測(cè)定吸光度值，計(jì)算加標(biāo)回收率［13］。

1.2.12 南瓜籽多糖含量測(cè)定 將市場(chǎng)上購(gòu)得的裸仁南瓜籽按方法1.2.1制備南瓜籽多糖，再按方法1.2.7測(cè)定其吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和換算因子計(jì)算出南瓜籽多糖的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長(zhǎng)的確定

最大吸收波長(zhǎng)掃描結(jié)果見圖1。由圖1可知，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和南瓜籽多糖溶液均在486 nm處有最大吸收，說明以葡萄糖為標(biāo)品測(cè)定南瓜籽多糖含量的方法可靠。因此以下試驗(yàn)均選取486 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2 濃硫酸用量的確定

圖1 最佳測(cè)定波長(zhǎng)的選擇Figure 1 Scanning spectra

濃硫酸用量對(duì)溶液吸光度的影響見圖2。由圖2可知，隨著濃硫酸加入量的增加，溶液的吸光度先升高后下降，當(dāng)濃硫酸加入量為5.0 m L時(shí)，吸光度達(dá)到最高值0.554，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＝0.26%（n＝3）。 加入量超過5.0 m L后，吸光度大幅度下降，可能是由于濃硫酸過多會(huì)使多糖碳化嚴(yán)重。由此，在以下的試驗(yàn)中使用5.0 m L濃硫酸。

圖2 不同硫酸用量的吸光度比較Figure 2 Effects of different sulfuric acid amounts on color results

2.3 6%苯酚溶液用量的確定

苯酚用量對(duì)溶液吸光度的影響見圖3。由圖3可知，隨著苯酚溶液用量的增加，多糖溶液的吸光值也相應(yīng)增加，并在1.0 m L時(shí)出現(xiàn)最大值0.500，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 RSD＝0.60%（n＝3），之后隨著苯酚溶液用量繼續(xù)增加吸光度下降，所以選取1.0 m L為最佳苯酚溶液用量。

圖3 不同苯酚用量的吸光度比較Figure 3 Effects of different phenol amounts on color results

2.4 顯色溫度的確定

顯色溫度對(duì)溶液吸光度的影響見圖4。由圖4可知，吸光度隨著顯色溫度提高同樣呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。在30℃時(shí)，吸光度值最高，為0.547，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 RSD＝0.62%（n＝3）。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，由于試管內(nèi)濃硫酸與多糖反應(yīng)劇烈放熱，迅速放進(jìn)冰水浴條件下顯色，極易造成具塞試管底部破裂。所以，30℃水浴為本試驗(yàn)的最佳顯色溫度。

2.5 顯色時(shí)間的確定

顯色時(shí)間對(duì)溶液吸光度的影響見圖5。由圖5可知，在30 min內(nèi)，隨著顯色時(shí)間的增加，吸光度逐漸升高，30 min時(shí)吸光度值為0.537，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＝0.32% （n＝3），之后南瓜籽多糖溶液的吸光度趨于平穩(wěn)，可能是水浴30 min時(shí)溶液恰好顯色完全。所以，本試驗(yàn)中水浴30 min為最佳顯色時(shí)間。

圖4 不同顯色溫度的吸光度比較Figure 4 Effects of different temperatures on color results

圖5 不同顯色時(shí)間的吸光度比較Figure 5 Effects of different developing time

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖6。由圖6可知，葡萄糖濃度在0～100μg／m L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。其回歸方程為y ＝0.012 3x－0.001 6，相關(guān)系數(shù)r為0.998 2。

2.7 換算因子的計(jì)算

圖6 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 6 Glucose standard curve on color results

按1.2.7方法測(cè)定南瓜籽多糖溶液的吸光度值為0.455，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算得葡萄糖質(zhì)量濃度為0.018 6 mg／m L，按照1.2.8中換算因子計(jì)算公式，計(jì)算得換算因子f＝10.75。

2.8 精密度試驗(yàn)

同一多糖溶液，相同條件重復(fù)測(cè)定吸光度5次，計(jì)算所得吸光度平均值0.507，標(biāo)準(zhǔn)偏差0.004 69，相對(duì)平均偏差RSD＝0.93% （n＝5），表明重現(xiàn)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

由表1可知，南瓜籽多糖溶液在120 min內(nèi)穩(wěn)定性良好，隨著時(shí)間的增加，吸光度值略有下降，尤其在前60 min內(nèi)吸光度值由最初0.504只降至0.501，120 min時(shí)降至0.496。相對(duì)平均偏差RSD＝0.66%。

2.10 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

經(jīng)計(jì)算南瓜籽多糖含量為20.66μg／m L（以葡萄糖計(jì)）。由表2可知，經(jīng)測(cè)定該方法的平均加標(biāo)回收率100.75%，相對(duì)平均偏差RSD＝0.83%（n＝3），說明該測(cè)定方法準(zhǔn)確可信。

表1 穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果Table 1 Results of stability experiments

表2 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The addition recovery result

2.11 南瓜籽多糖含量測(cè)定

按方法1.2.7測(cè)定南瓜籽多糖溶液吸光度值為0.439，從而計(jì)算出南瓜籽粗多糖中總糖含量為17.9%。

3 結(jié)論

使用苯酚－硫酸法測(cè)定南瓜籽多糖含量，濃硫酸用量、苯酚溶液用量、顯色時(shí)間、顯色溫度等因素對(duì)南瓜籽多糖溶液的吸光度均有不同程度的影響，通過優(yōu)化上述試驗(yàn)條件，得出較優(yōu)條件為波長(zhǎng)486 nm，6%苯酚溶液1.0 m L，濃硫酸5.0 m L，在30℃水浴30 min的條件下顯色，平均加標(biāo)回收率為100.75%，RSD為0.83%，測(cè)得樣品中多糖的含量為17.9%。該方法穩(wěn)定性和重復(fù)性較好，簡(jiǎn)便快速，適用于南瓜籽中多糖含量的定量測(cè)定。

本試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)在南瓜籽中的確含有一定量的多糖成分，以此為基礎(chǔ)，筆者正在進(jìn)一步展開對(duì)南瓜籽中多糖的生物活性及其功能的研究，研究成果將有望彌補(bǔ)國(guó)內(nèi)外在該領(lǐng)域的研究空白。

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