超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定人血漿中阿托伐他汀濃度

戴 立，吳曉莉，楊昌云，甘惠貞

（中國人民解放軍第180醫(yī)院藥學科，福建 泉州 362000）

阿托伐他?。╝torvastatin，ATV）是具有選擇性和競爭性的羥 甲戊二酰輔酶 A（HMG-CoA）還原酶抑制劑，能降低總膽固醇、低密度脂蛋白和三酰甘油的血漿濃度，臨床廣泛用于治療冠心病和血脂異常等疾病[1]。阿托伐他汀口服吸收迅速，且存在明顯的首關(guān)效應(yīng)，絕對生物利用度僅12%，大劑量服用后可能發(fā)生橫紋肌溶解等不良反應(yīng)[2]，臨床使用過程中發(fā)現(xiàn)其在療效及不良反應(yīng)方面均存在個體差異，而此現(xiàn)象是否與阿托伐他汀的血藥濃度之間存在聯(lián)系，有待研究證實。為研究阿托伐他汀在人體的藥動學過程及治療藥物監(jiān)測的需要，本試驗中建立了靈敏度較高的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法，用于測定阿托伐他汀血藥濃度。

1 儀器與試藥

Acquity UPLC H-class色譜系統(tǒng)、Xevo TQD質(zhì)譜儀（Waters公司）；Heraeus Pico21離心機（美國賽默飛世爾科技公司）；AE240型雙量程電分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；G560E型渦旋混合儀；pHS-3C型精密pH計（上海雷磁儀器廠）；HSC-12A型氮吹儀（天津恒奧科技發(fā)展有限公司）；CQX25-06型超聲波清洗器（上海必能信超聲有限公司）；微孔濾膜（0.22μm，美國津騰公司）。阿托伐他汀鈣對照品（批號為23922106，LKT公司，含量99.2%）；黃體酮（批號為100027-200307，中國藥品生物制品檢定所）；乙腈、甲酸（Darmstadt Germany Merck KgaA）；甲醇、乙酸乙酯、冰乙酸、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉均為分析純（上海強順化學試劑有限公司）；去離子水（自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 標準溶液配制

稱取阿托伐他汀鈣對照品0.8 mg，精密稱定，用流動相溶解并定容于100 mL容量瓶中，配制成8μg/mL的對照品貯備液。另稱取黃體酮對照品2 mg，精密稱定，用流動相溶解并定容，配制成200 ng/mL的黃體酮內(nèi)標溶液。將貯備液置4℃冰箱保存，備用。

2.2 檢測條件

色譜條件:色譜柱為 AcquityUPLCBEHC18柱（50mm×2.1mm，1.7 μm，Waters公司），柱溫 40 ℃ ，流動相為乙腈 -含 0.01% 甲酸的水溶液（70 ∶30），流速 0.3mL /min，進樣量 10 μL。

質(zhì)譜條件:采用電噴霧正電離源（ESI+），多反應(yīng)離子監(jiān)測模式（MRM），毛細管電離電壓3.18 kV，錐孔電壓16 V，脫溶劑氣溫度600℃，氣流量1 000 L/h，碰撞氣體為 Ar氣，碰撞能量20 V，源溫度150℃。

2.3 樣品預(yù)處理

取正常人群體檢剩余血液樣品，經(jīng)抗凝劑EDTA-2K作用下提取血漿，作為本試驗的模擬血漿樣品。取模擬血漿樣品1 mL，加入內(nèi)標貯備液 35μL、pH＝4.9的磷酸鹽緩沖液 300μL、乙酸乙酯 3 mL，渦旋萃取 1.5 min，離心（4 000 r/min）3 min，取上層有機相于50℃水浴氮氣揮干，殘留物用500μL流動相渦旋溶解5min，離心（4 000 r/min）3min，經(jīng) 0.22 μm 微孔濾膜過濾，進樣10μL。

2.4 干擾試驗

按2.2項下條件測定，質(zhì)譜圖見圖1。阿托伐他汀與內(nèi)標物質(zhì)在各自離子通道上無內(nèi)源性雜質(zhì)干擾，色譜峰形良好，阿托伐他汀的保留時間約為0.63min，黃體酮的保留時間約為0.91min。

2.5 標準曲線與檢測靈敏度試驗

精密吸取阿托伐他汀對照品貯備液適量，以空白血漿為溶劑，配成質(zhì)量濃度為 0.01，0.05，0.10，0.20，0.50，1.00，5.00，10.00，20.00，50.00 ng /mL 的系列含對照品的血漿樣品。按 2.3項下方法處理后，以阿托伐他汀與內(nèi)標物峰面積比值（R）對質(zhì)量濃度（C）進行回歸分析，得回歸方程 R ＝0.160 7C+0.000 5，r＝0.998 9（n＝10）。另按同樣方法配制 0.01 ng/mL 的標準含藥血漿，按2.3項下方法處理后，用流動相反復稀釋，依法測定，得最低檢測質(zhì)量濃度為 0.002 ng/mL（S /N≥3）。

圖1 質(zhì)譜圖

2.6 萃取回收率試驗

取空白血漿，加入適量的阿托伐他汀對照品貯備液，配成低、中、高（0.02，1.00，50.00 ng/mL）3 種質(zhì)量濃度的標準含藥血漿樣品各5份。按2.3項下方法處理后分析，記錄阿托伐他汀峰面積（A1）；另取空白血漿 1 mL，按 2.3項下處理，水浴、氮氣揮干后，殘余物用 0.02，1.00，50.00 ng /mL 3 種質(zhì)量濃度的對照品溶液溶解，進樣，記錄阿托伐他汀峰面積（A2）。以 A1/A2計算萃取回收率。結(jié)果見表1。

表1 阿托伐他汀萃取回收率試驗結(jié)果（n＝5，±s）

表1 阿托伐他汀萃取回收率試驗結(jié)果（n＝5，±s）

質(zhì)量濃度（n g/mL）0.0 2 1.0 5 0.0萃取回收率（%）7 6.5 ± 2.6 7 7 5.0 ± 1.8 1 7 3.2 ± 0.9 4 R S D（%）3.4 9 2.4 1 1.2 9

2.7 回收率和精密度試驗

取阿托伐他汀對照品溶液及空白血漿，配成低、中、高（0.02，1.00，50.00 ng/mL）3 種質(zhì)量濃度的標準含藥血漿樣品，各 5 份，以2.3項下方法處理，進樣分析，所得結(jié)果代入線性回歸方程計算得實測質(zhì)量濃度，并與已知加入質(zhì)量濃度相比，得方法回收率。同法配制3種質(zhì)量濃度含藥血漿樣品，依法處理，于同日內(nèi)5次、連續(xù)5日進樣分析，考察精密度。結(jié)果見表2，方法回收率為95% ～106%，日內(nèi)、日間精密度的 RSD均≤5%。

表2 阿托伐他汀回收率和精密度試驗結(jié)果（n＝5，±s）

表2 阿托伐他汀回收率和精密度試驗結(jié)果（n＝5，±s）

質(zhì)量濃度（n g /mL）回收率（%） 精密度的 R S D（%）0.0 2 1.0 5 0.0±s 9 8.0 ± 4.4 7 9 9.3 ± 2.7 8 1 0 3.0 ± 2.9 4 R S D 4.5 6 2.1 4 2.6 5日內(nèi)4.6 1 1.5 4 2.4 0日間4.5 6 3.9 0 3.7 1

2.8 樣品穩(wěn)定性試驗

取空白血漿，加入適量阿托伐他汀對照品貯備液，配成質(zhì)量濃度分別為 0.02，1.00，50 ng /mL 的低、中、高含藥血漿樣品各兩份，分別于常溫或-20℃反復凍融，按2.3項下方法處理后進樣測定，共測定5 d，以第1天測得質(zhì)量濃度為100%，考察穩(wěn)定性。結(jié)果見表3。

表3 阿托伐他汀穩(wěn)定性試驗結(jié)果（n＝5，±s）

表3 阿托伐他汀穩(wěn)定性試驗結(jié)果（n＝5，±s）

條件相對含量(%)室溫反復凍融質(zhì)量濃度（n g /mL）0.0 2 1.0 0 5 0.0 0 0.0 2 1.0 0 5 0.0 0 1 d 1 0 0.0 1 0 0.0 1 0 0.0 1 0 0.0 1 0 0.0 1 0 0.0 2 d 1 0 0.0 9 9.5 9 6.4 1 0 0.0 9 8.8 9 9.8 3 d 9 0.0 9 2.7 9 6.0 1 0 0.0 9 8.2 9 8.9 4 d 9 0.0 9 1.7 9 3.2 1 0 0.0 9 7.8 9 8.4 5 d 8 5.0 8 7.0 9 2.5 9 4.5 9 3.5 9 7.8 R S D（%）7.2 1 5.9 9 4.2 8 3.5 2 2.4 1 1.3 3

3 討論

目前阿托伐他汀血藥濃度的測定方法有高效液相色譜-紫外分光光度（HPLC-UV）法[3]和高效液相色譜 -質(zhì)譜（HPLCMS）法[4]。前者靈敏度較低，無法較靈敏地檢測出阿托伐他汀消除相中的血藥濃度。后者報道的最低檢出質(zhì)量濃度為0.25 ng/mL，本試驗對其作適當改進，使血藥濃度最低定量限達0.01 ng/mL，保留時間由4.16min縮短到1min以內(nèi)，提高了分析準確度、靈敏度和分析效率。

本試驗中采用液-液萃取的方法處理血樣。在萃取劑的選擇中，比較了環(huán)己烷、二氯甲烷、氯仿和環(huán)己烷-二氯甲烷（3.5∶1）對阿托伐他汀的萃取效果，結(jié)果顯示，這些試劑雖可減少雜質(zhì)干擾，但萃取回收率均低于35%；以正戊烷為萃取劑時，提取回收率較高，但樣品容易乳化。以乙酸乙酯萃取，可顯著減少雜質(zhì)干擾，且兩次萃取的回收率可達90%，比僅萃取1次的回收率提高約20%，由于一次萃取已可使生物樣品的純化和濃集滿足分析要求，操作更便捷，故采取一次萃取。

阿托伐他汀的相對分子質(zhì)量為557.71，而用質(zhì)譜測得的質(zhì)荷比是559.2，可能是在離子化過程中阿托伐他汀獲得1個質(zhì)子后所得離子化物質(zhì)的質(zhì)荷比。同理，黃體酮的相對分子質(zhì)量是314.47，而檢測到的黃體酮質(zhì)荷比是315.5。

選擇流動相時，比較了乙腈-甲醇-水[5]和乙腈 -含0.01%甲酸的水溶液（70∶30），結(jié)果前者的阿托伐他汀色譜峰有拖尾現(xiàn)象，且阿托伐他汀在乙腈中的穩(wěn)定性比甲醇好，因此用乙腈為溶劑和流動相的成分。乙腈含量過高時，阿托伐他汀保留時間過短，且易受血中雜質(zhì)干擾，適當降低乙腈的含量至70%使阿托伐他汀的保留時間在0.62 min時，藥物及內(nèi)標可與血漿中內(nèi)源性物質(zhì)達到基線分離。流動相中加入適當?shù)募姿幔稍黾影⑼蟹ニ〉碾x子化效應(yīng)，顯著提高方法的靈敏度和分離效果。

以內(nèi)標法定量可改善試驗的準確度和精密度。文獻[6]采用尼莫地平為內(nèi)標，考慮到有可能受臨床伍用該藥而影響測定，故選用黃體酮為內(nèi)標。在擬訂的色譜條件下，黃體硐可與待測物適當分離，與待測物和內(nèi)源性雜質(zhì)在各自的離子通道上不會互相干擾，且1 min內(nèi)可完成測定。黃體酮為人體內(nèi)源性物質(zhì)，在正常人群中的含量均小于0.002 ng/mL，占本試驗中所加入內(nèi)標含量的0.04%，對測定影響較小。

文獻[7]報道，阿托伐他汀在人體內(nèi)的有效血藥濃度為0.25～25 ng/mL，而本試驗所測得的血藥濃度為 0.01～50 ng/mL，這為臨床研究阿托伐他汀消除相的濃度范圍時提供了良好的依據(jù)。

綜上所述，文中擬訂的方法準確、靈敏、穩(wěn)定、簡便，適用于阿托伐他汀血藥濃度測定。

參考文獻:

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[6]劉 巍，張 慶.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定人血漿苯磺酸氨氯地平與阿托伐他汀鈣濃度[J].醫(yī)藥導報，2010，29（6）:698-700.

[7]William W Bullen，Ronald A Miller，Roger N Hayes.Development and Validation of a High-Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry Assay for Atorvastatin，Ortho-Hydroxy Atorvastatin，and Para-Hydroxy Atorvastatin in Human，Dog，and Rat Plasma[J].JAm Soc Mass Spectrom，1999，10:55-66.