葛根總黃酮的提取精制及含量測(cè)定方法研究

陳志民，黃 陽(yáng)，郭瑩瑩，楊昌云

(中國(guó)人民解放軍第180醫(yī)院藥學(xué)科，福建 泉州 362000)

葛根為豆科植物野葛 Pueraria lobata Ohwi或粉葛 Pueraria thomsonii Benth.的干燥根，具有解肌退熱、升陽(yáng)止瀉、透疹生津的功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，葛根具有改善心腦血管循環(huán)、擴(kuò)張冠脈、改善心臟功能等作用[1－2]。同時(shí)，葛根還有提高學(xué)習(xí)記憶力、抗氧化、抗癌等作用。葛根中主要含有總黃酮這一活性成分，包括葛根素、大豆苷、大豆苷元等異黃酮類化合物。目前，葛根已被制成愈風(fēng)寧心片、葛根素注射劑等多種制劑上市，這些制劑皆以葛根總黃酮為藥效成分。本試驗(yàn)旨在探討不同濃度乙醇對(duì)總黃酮提取條件的影響，并用溶劑法對(duì)其純化。研究表明乙醇回流提取黃酮得率較高[3－5]，本試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行優(yōu)選研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

UV－8543型可見(jiàn)紫外分光光度計(jì)（美國(guó)惠普公司）；1100型高效液相色譜儀（Agilent公司），DAD紫外檢測(cè)器，Zorbax S8－C18柱（250mm ×4.6mm，5 μm）。葛根素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為0752－9806）；甲醇和乙腈為色譜醇；乙醇為市售分析純；葛根藥材（廣州致信中藥飲片有限公司，粵Y20090085）。

2 方法與結(jié)果

2.1 葛根總黃酮含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件

流動(dòng)相：甲醇－水－乙腈（12∶80 ∶8）；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；流速：0.8 mL/min；柱溫：25 ℃。

2.1.2 溶液制備

精密稱取葛根素對(duì)照品2mg，用甲醇溶解并定容于100 mL容量瓶中，避光、室溫下保存，即得對(duì)照品溶液。按照2010年版《中國(guó)藥典（一部）》[6]葛根供試品溶液的制備方法，取一定量葛根藥材粉末（過(guò)3號(hào)篩），分別依法制備供試品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：稱取葛根素對(duì)照品約2mg，精密稱定，用甲醇溶解并定容于 100 mL 容量瓶中，精密稱取 0，1.5，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL，置 10 mL 容量瓶中，甲醇定容。以甲醇為空白，在250 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。結(jié)果見(jiàn)表1。以吸光度 A值對(duì)濃度(C，μg/mL)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 A ＝0.076 8 C ＋0.001 6，R2＝ 0.999 8(n ＝ 6)。

表1 不同質(zhì)量濃度葛根素在250 nm波長(zhǎng)處的吸光度

精密度試驗(yàn)：取葛根素對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，分別測(cè)定峰面積。結(jié)果的 RSD為0.84%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：依法制備10 μg/mL對(duì)照品溶液6份，進(jìn)樣測(cè)定。峰面積結(jié)果的 RSD為1.1%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于 0，2，4，6，8 h 時(shí)進(jìn)樣分析，根據(jù)葛根素的峰面積計(jì)算。結(jié)果的 RSD為1.0%（n＝5），表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取8 μg/mL供試品溶液9份，各500 μL，置5 mL容量瓶中，分別加質(zhì)量濃度為10 μg/mL的對(duì)照品溶液300，500，1 000 μL，每個(gè)質(zhì)量濃度平行 3份，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，取10 μL進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

2.2 不同批次葛根藥材的含量測(cè)定

取4個(gè)批次的葛根藥材粉末（過(guò)3號(hào)篩），依法分別制備供試品溶液，照2010年版《中國(guó)藥典（一部）》附錄ⅥD中高效液相色譜法，精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL進(jìn)樣測(cè)定。色譜圖見(jiàn)圖1，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。表明各批次藥材葛根素含量均高于《中國(guó)藥典》規(guī)定，符合要求，故選取接近平均含量的第4批藥材作為下一步試驗(yàn)用藥。

圖1 高效液相色譜圖

2.3 葛根總黃酮提取工藝研究

根據(jù)文獻(xiàn)資料葛根黃酮提取方法[7]，確定葛根提取方法如下。分別取葛根藥材100 g，分別加入10倍量95%乙醇和70%乙醇1 000 mL，加熱回流3 h，濾過(guò)，殘?jiān)尤?倍量乙醇，繼續(xù)回流3 h，濾過(guò)，合并濾液，減壓回收乙醇，得到浸膏，真空干燥箱干燥，得葛根提取物。分別精密稱取醇提物0.1 g置100 mL容量瓶中，加入95%乙醇溶解并定容，精密量取1.0 mL置100 mL容量瓶中，加入95%乙醇定容至刻度，搖勻，照分光光度法[2010年版《中國(guó)藥典(一部)》附錄ⅤB]，在250 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明，采取95%乙醇回流提取 2次，每次3 h，乙醇用量第 1次 10倍量，第2次 8倍量，提取效果較好。

表3 不同批次葛根藥材葛根素含量測(cè)定結(jié)果

表4 不同濃度乙醇提取葛根結(jié)果

2.4 葛根總黃酮純化工藝研究

2.4.1 葛根總黃酮純化方法考察

回流法：精密稱取醇提物粉末0.5 g，置錐形瓶中，加入球形微晶纖維素2.0 g分散粉末，加入乙酸乙酯20 mL，稱定質(zhì)重。水浴回流1 h，放冷，補(bǔ)足乙酸乙酯減失量。抽濾，濾液蒸干。測(cè)定蒸發(fā)皿前后質(zhì)量，得固形物質(zhì)量。用95%乙醇溶解固形物，并定容于50 mL容量瓶中，精密量取1.0 mL置25 mL容量瓶中，定容，再精密量取1.0 mL置10 mL容量瓶中，定容后搖勻，照分光光度法[2010年版《中國(guó)藥典（一部)》附錄Ⅴ B]，在 250 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 兩種純化方法的比較

萃取法：精密稱取醇提物粉末0.5 g，置25 mL容量瓶中，加入乙醇20 mL。微熱，溶解，轉(zhuǎn)移至125 mL分液漏斗中，加入乙酸乙酯20 mL，萃取，分取乙酸乙酯層，萃取3次，合并乙酸乙酯層，水浴蒸干。測(cè)定蒸發(fā)皿前后質(zhì)量，得固形物質(zhì)量。用95%乙醇溶解固形物，并定容于50 mL容量瓶中，精密量取1.0 g置25 mL容量瓶中，定容，再精密稱取1.0 mL置10 mL容量瓶中，定容后搖勻，照分光光度法[2010年版《中國(guó)藥典（一部)附錄ⅤB]，在250 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表5?？梢?jiàn)，溶劑萃取法純化葛根總黃酮效果較好。

2.4.2 萃取純化法優(yōu)化

試驗(yàn)證明，醇提物溶于不同濃度的乙醇對(duì)萃取效率有較大影響。故本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了3種濃度的乙醇溶解葛根醇提物后再萃取，試驗(yàn)方法同萃取法，結(jié)果見(jiàn)表6?？梢?jiàn)，用30%乙醇溶解樣品后再用乙酸乙酯萃取總黃酮可達(dá)到較好的純化效果。

表6 不同濃度乙醇對(duì)總黃酮純化的影響

3 討論

通過(guò)高效液相色譜法，以葛根素為指標(biāo)，評(píng)價(jià)不同批次葛根藥材的質(zhì)量，具有準(zhǔn)確、可靠、快速的優(yōu)點(diǎn)，保證了試驗(yàn)用藥材的質(zhì)量。

確定了葛根藥材的提取工藝，95%乙醇回流提取2次，每次3 h，乙醇用量第1次10倍量，第2次8倍量。該工藝對(duì)于總黃酮粗提物的純度及轉(zhuǎn)移率較高。

對(duì)于總黃酮的純化，大多采用聚酰胺、大孔樹(shù)脂法，這些方法均能得到純度較高的總黃酮，但生產(chǎn)周期長(zhǎng)，工藝復(fù)雜，成本較高[8]。本研究采用一定量乙酸乙酯萃取法純化總黃酮，成本較低，周期短，乙酸乙酯可重復(fù)利用，具有工業(yè)化前景。

參考文獻(xiàn)：

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