運(yùn)動(dòng)通過改善PD模型小鼠紋狀體D2MSN-D1MSN側(cè)抑制效應(yīng)調(diào)節(jié)基底神經(jīng)節(jié)信息輸出

趙 剛，劉曉莉，喬德才

（北京師范大學(xué) 體育與運(yùn)動(dòng)學(xué)院，北京100875）

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是一種由于黑質(zhì)-紋狀體環(huán)路多巴胺（dopamine，DA）能神經(jīng)元凋亡導(dǎo)致的神經(jīng)退行性疾病，基底神經(jīng)節(jié)直接/間接通路失衡引起的機(jī)體運(yùn)動(dòng)功能障礙是PD 的主要病理特征。紋狀體是皮層信息輸入基底神經(jīng)節(jié)的主要核團(tuán)，也是基底神經(jīng)節(jié)的中央加工區(qū)，約95%的神經(jīng)元為中等多棘神經(jīng)元（medium spiny neuron，MSN），根據(jù)紋狀體細(xì)胞膜上DA 受體類型可分為表達(dá)D1R 調(diào)控直接通路的MSN（D1-MSN）和表達(dá)D2R 調(diào)控間接通路的MSN（D2-MSN）（Gagnon et al.，2017）。新近神經(jīng)解剖學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，在紋狀體核團(tuán)內(nèi)不同類型的MSNs 高度疊加，相鄰的MSN 之間形成γ-氨基丁酸（γ－aminobutyric acid，GABA）能突觸連接，被稱為側(cè)抑制突觸，并對(duì)直接/間接通路產(chǎn)生側(cè)抑制效應(yīng)（Faust et al.，2016）。PD 患者靜止性震顫等精細(xì)運(yùn)動(dòng)功能障礙均可能與紋狀體MSN 側(cè)抑制效應(yīng)的異常有關(guān)（Bian et al.，2015）。

在2008年，Taverna 等（2008）證實(shí)PD 動(dòng)物模型存在紋狀體D2-MSN 側(cè)抑制突觸連接減弱的現(xiàn)象。PD 病理狀態(tài)下這種樹突棘的減少被認(rèn)為是導(dǎo)致基底神經(jīng)節(jié)功能異常的解剖學(xué)基礎(chǔ)（Surmeier et al.，2014）。本實(shí)驗(yàn)室前期研究已經(jīng)證實(shí)，4 周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可緩解PD 小鼠紋狀體D2-MSN樹突棘脫落的現(xiàn)象（陳平，2018）；紋狀體D2-MSN 樹突棘的運(yùn)動(dòng)依賴性重塑不僅在改善PD 小鼠皮層-紋狀體突觸傳遞和D2-MSN 興奮性方面具有一定調(diào)節(jié)作用，而且也可能是重塑PD 小鼠紋狀體D2-MSN 側(cè)抑制突觸連接的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)（趙剛 等，2019a）。為此，本研究擬采用光刺激靶向性操控D2-MSN 興奮性，探討D2-MSN 對(duì)D1-MSN 的側(cè)抑制效應(yīng)對(duì)基底神經(jīng)節(jié)信息輸出的影響，進(jìn)一步從突觸及通路水平上解釋D2-MSN 在運(yùn)動(dòng)改善PD 小鼠基底神經(jīng)節(jié)信息輸出中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

4 周齡雄性D2-Cre 轉(zhuǎn)基因小鼠，由北京師范大學(xué)腦與認(rèn)知研究院提供。小鼠分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)過程中自然光照，保持自由進(jìn)食飲水，室溫22℃±2℃，相對(duì)濕度40%～60%。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案均經(jīng)北京師范大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R 原則，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給予人道主義關(guān)懷。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，隨機(jī)分為對(duì)照組（D2-Cre）和模型組，模型組經(jīng)鑒定符合PD 模型的小鼠再隨機(jī)分為PD 組（PDD2-Cre）和PD 運(yùn)動(dòng)組（PD+ExD2-Cre），每組各12 只（6 只用于電生理學(xué)實(shí)驗(yàn)，6 只用于行為學(xué)和免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)）。

1.2 光敏感蛋白轉(zhuǎn)染及鑒定

病毒注射前24 h 小鼠禁食，自由飲水。術(shù)前通過腹腔注射5%水合氯醛（350 μg/g）麻醉，使用立體定位儀定位，在小鼠紋狀體右側(cè)（AP：+0.5 mm；R：1.8 mm；DV：-3.0 mm）注入興奮性光敏感蛋白病毒（rAAV-Ef1α-DIOChR2-EYFP-WPRE-pA，樞密，武漢）（滴度≥2.00E+12 vg/ml）1 μl，以0.1 μl/min 的速度注射完成后留針3 min，緩慢移出注射器，縫合創(chuàng)面，并于縫合處涂抹青霉素預(yù)防感染，待小鼠清醒后單籠飼養(yǎng)。視紫紅質(zhì)通道蛋白（Channelrhodopsin-2，ChR2）是一種受光脈沖控制的興奮性陽(yáng)離子通道蛋白，表達(dá)ChR2 蛋白的細(xì)胞在藍(lán)光刺激下使通道打開，Na+、Ca2+等進(jìn)入細(xì)胞，產(chǎn)生一內(nèi)向電流，引起細(xì)胞去極化，從而興奮神經(jīng)元。

1.3 PD模型小鼠制備、評(píng)價(jià)及運(yùn)動(dòng)干預(yù)方案

光敏感蛋白轉(zhuǎn)染2 周后，腹腔注射5%水合氯醛麻醉（350 μg/g），將小鼠固定在立體定位儀上，沿顱頂矢狀縫切開皮膚，在右側(cè)紋狀體（AP：+0.5 mm，R：1.8 mm）鉆孔，用微量注射器（Legato，KDS，美國(guó)）在顱骨下-3.0 mm 和-2.0 mm 不同深度分別注入6-羥基多巴胺（6-Hydroxydopamine hydrobromide，6-OHDA，Sigma，美國(guó)）溶液（2 μg/μl，含0.02%抗壞血酸）4 μl，以0.5 μl/min 的速度注射完成后留針3～5 min，勻速退出進(jìn)樣器，縫合處理創(chuàng)面。6-OHDA 為選擇性兒茶酚胺類神經(jīng)化學(xué)損毀劑，進(jìn)入體內(nèi)后易氧化生成羥自由基和醌類等神經(jīng)毒物，特異性地?fù)p毀黑質(zhì)致密部DA 能神經(jīng)元，引起DA 生成減少，黑質(zhì)-紋狀體DA系統(tǒng)功能退變，一般用于制備穩(wěn)定有效的PD 動(dòng)物模型。

6-OHDA 注射后第7 天及4 周運(yùn)動(dòng)干預(yù)后24 h，各組小鼠腹腔注射APO（0.5 μg/g）誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)行為，記錄30 min內(nèi)小鼠的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)。以向損傷側(cè)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)與向健側(cè)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)的差值作為小鼠凈旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，凈旋轉(zhuǎn)圈數(shù)＞120 r/30 min 作為PD 小鼠模型制備成功的標(biāo)準(zhǔn)，剔除未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的小鼠（于燕 等，2015）。

運(yùn)動(dòng)干預(yù)方案采用勻速跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)（18 m/min，40 min/天，連續(xù)5 天/周，共4 周），運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度約為70%～76%V·O2max（H?ydal et al.，2007）。PD+ExD2-Cre組 在6-OHDA 注 射1 周后開始運(yùn)動(dòng)干預(yù)；非運(yùn)動(dòng)組小鼠置于跑臺(tái)中相同時(shí)間，但不參與運(yùn)動(dòng)。

1.4 離體腦片制備

所有實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)各組小鼠腹腔注射水合氯醛麻醉（5%，500 μg/g），斷頭取全腦，在0℃氧飽和的改良人工腦脊液（modified artificial cerebrospinal fluid，mACSF）中修塊。使用高速振動(dòng)切片機(jī)（VT1200S，Leica，德國(guó)）對(duì)修塊后的腦組織紋狀體進(jìn)行冠狀切片（厚度400 μm，切片過程中持續(xù)通氧）。將腦片在人工腦脊液（artificial cerebro spinal fluid，ACSF）孵育槽中孵育1 h 以上備用，孵育過程中保持31℃并持續(xù)通入混合氣體（95% O2/5% CO2）。

1.5 全細(xì)胞膜片鉗記錄

將腦片固定于記錄槽中央（灌流氧飽和的ACSF），利用顯微鏡微分干涉相差成像系統(tǒng)和紅外COD 攝像機(jī)（顯微鏡選擇熒光模式），在視野中選取有熒光反應(yīng)且狀態(tài)良好的紋狀體D2-MSN，以此為視野中心，反復(fù)切換熒光和普通模式尋找狀態(tài)良好、不具有熒光反應(yīng)的D1-MSN。操作機(jī)械臂將記錄電極移入記錄槽中，入液阻抗約為5～9 MΩ。給予記錄電極正氣壓，移動(dòng)電極將電極尖端壓至D1-MSN 胞體表面，觀察到胞體壓痕并且電極阻抗上升后釋放正壓并持續(xù)給予低強(qiáng)度負(fù)壓；同時(shí)給予-70 mV 鉗制電壓，電極阻抗逐漸上升高于1 GΩ 時(shí)形成高阻封接。記錄波形趨于平緩，封接狀態(tài)穩(wěn)定后給予強(qiáng)而短促的負(fù)壓或通過放大器給予Zap 電流刺激，破膜形成全細(xì)胞記錄（馬婧 等，2018）。

所有原始信號(hào)都通過膜片鉗放大器（MultiClamp 700B，Molecular Devices，美國(guó)）檢測(cè)、放大，1 KHz Bessel低通濾波，再經(jīng)數(shù)模轉(zhuǎn)換器（Digidata 1550A，Molecular Devices，美國(guó)），導(dǎo)入pClamp 10.5 軟件記錄。以串聯(lián)電阻≤25 MΩ，靜息膜電位≤-70 mV，且整個(gè)記錄過程中變化幅度＜20%為標(biāo)準(zhǔn)判斷是否進(jìn)行后續(xù)膜片鉗實(shí)驗(yàn)（馬婧，2015）。

動(dòng)作電位的記錄（action potential，AP）：在電流鉗模式下，給予D1-MSN 步階變化的刺激電流，使其爆發(fā)動(dòng)作電位。給予刺激電流（500 ms，0.1 Hz，-100～500 pA，以每20 pA 的步階遞增），統(tǒng)計(jì)隨著注入電流的增大，D1-MSN爆發(fā)動(dòng)作電位的放電頻率。通過473 nm 藍(lán)色激光刺激視野中心位置的D2-MSN，統(tǒng)計(jì)光刺激后D1-MSN 動(dòng)作電位的發(fā)放頻率。

光刺激誘發(fā)的抑制性突觸后電流（optogenetic stimulation evoked inhibitory postsynaptic currents，oIPSC）：ACSF加入CNQX（10 μM，谷氨酸受體AMPAR 拮抗劑）和AP5（50 μM，谷氨酸受體NMDAR 拮抗劑），將細(xì)胞膜電位鉗制在-55 mV。待藥物起作用后，穩(wěn)定記錄D1-MSN IPSC 5 min 作為基線數(shù)據(jù)。通過473 nm 藍(lán)色激光照射視野中心位置的D2-MSN（50 ms on/50 ms off），穩(wěn)定記錄D1-MSN oIPSC 5 min（baseline，base）后向ACSF 中加入多巴胺II 型受體（dopamine type II receptor，D2R）激動(dòng)劑喹吡羅（5 μM ，quinpirole，Quin），穩(wěn)定記錄oIPSC 5 min。通過循環(huán)泵加入ACSF（含CNQX 10 μM 和AP5 50 μM）快速洗脫，穩(wěn)定記錄oIPSC 5 min，統(tǒng)計(jì)加入Quin 后oIPSC 幅值與基線base 的比值。

1.6 紋狀體-黑質(zhì)網(wǎng)狀部抑制性突觸后場(chǎng)電位的記錄

刺激電極置于紋狀體背外側(cè)，玻璃記錄電極置于黑質(zhì)網(wǎng)狀部（substantia nigrapars reticular，SNr），ACSF 需加入CNQX（10 μM）以及AP5（50 μM），阻斷Glu 介導(dǎo)的興奮性電流，記錄紋狀體-黑質(zhì)網(wǎng)狀部通路的抑制性突觸后場(chǎng)電位（field inhibitory post synaptic potential，fIPSP）。給予強(qiáng)度遞增的電流刺激，獲得紋狀體產(chǎn)生fIPSP 的最小刺激強(qiáng)度，并增加刺激強(qiáng)度獲得最大fIPSP 幅值；每30 s 給予1 個(gè)該強(qiáng)度的刺激，穩(wěn)定記錄15 min 基線；基線穩(wěn)定后，刺激強(qiáng)度維持不變，同步給予紋狀體腦區(qū)D2-MSN 473 nm 藍(lán)光刺激（50 ms off/50 ms on），記錄5 組fIPSP，取其平均值。

1.7 紋狀體絡(luò)氨酸羥化酶表達(dá)水平檢測(cè)

小鼠腹腔注射5%水合氯醛麻醉（350 μg/g），經(jīng)左心室-升主動(dòng)脈插管灌流（30 ml 生理鹽水和30 ml 4%多聚甲醛溶液），灌流結(jié)束后迅速取出腦組織置于4%的多聚甲醛溶液中固定24 h。將腦組織取出后置于30%的蔗糖溶液中進(jìn)行脫水后修塊、包埋，修整并進(jìn)行冠狀切片，每只6張腦片切片（10 μm）。對(duì)腦片切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，按照1：1 000 稀釋加入一抗（兔多克隆抗體，Abcam，美國(guó)），按照1：200 稀釋加入二抗（過氧化物標(biāo)記的抗兔IgG抗體，KPL，美國(guó)），熒光顯微鏡（DP72，Olympus，美國(guó)）對(duì)紋狀體背側(cè)區(qū)域拍照。采用Image-Pro Plus 6.0 軟件對(duì)絡(luò)氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）免疫陽(yáng)性纖維光密度（optical density，OD）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.8 數(shù)據(jù)處理

所有電生理數(shù)據(jù)均以Mean±SEM 表示，其余行為學(xué)及免疫組織化學(xué)數(shù)據(jù)均以M±SD表示。利用pClamp 10.5軟件分析oIPSC 數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)oIPSC 的幅值。利用SPSS 20.0軟件采用單因素方差分析和卡方檢驗(yàn)分析各指標(biāo)的組間差異，P＜0.05 表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 研究結(jié)果

2.1 PD小鼠模型及紋狀體光敏感蛋白轉(zhuǎn)染情況鑒定

本實(shí)驗(yàn)中共用38 只小鼠采用紋狀體同一位點(diǎn)、不同深度注射6-OHDA 的方法建立小鼠PD 模型，符合PD 模型標(biāo)準(zhǔn)的小鼠共24 只，成模率為63.15%。成模小鼠APO 旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為189.23±16.46 r/30 min，凈轉(zhuǎn)數(shù)大于120 r/30 min。4 周運(yùn)動(dòng)干預(yù)后各組小鼠APO 誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)結(jié)果如圖1B 所示，D2-Cre 組小鼠凈旋轉(zhuǎn)圈數(shù)為35.16±8.76 r/30 min，PDD2-Cre組小鼠凈旋轉(zhuǎn)圈數(shù)為184.23±11.26 r/30 min，PD+ExD2-Cre組小鼠凈旋轉(zhuǎn)圈數(shù)為166.5±7.96 r/30 min；PDD2-Cre組小鼠凈旋轉(zhuǎn)圈數(shù)較D2-Cre 組顯著增加（P＜0.01），PD+ExD2-Cre組凈旋轉(zhuǎn)圈數(shù)較PD 組顯著降低（P＜0.05），但仍顯著高于D2-Cre 組（P＜0.01）。

圖1 各組小鼠APO誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)統(tǒng)計(jì)Figure 1.The Numbers of APO-induced Rotations in Each Group

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，PDD2-Cre及PD+ExD2-Cre組小鼠損毀側(cè)（右側(cè)）紋狀體TH 陽(yáng)性纖維出現(xiàn)嚴(yán)重丟失（圖2A）。PDD2-Cre及PD+ExD2-Cre組小鼠紋狀體損傷側(cè)/未損傷側(cè)TH 陽(yáng)性纖維表達(dá)比值顯著低于D2-Cre 組（P＜0.05），PDD2-Cre及PD+ExD2-Cre組之間無顯著性差異（P＞0.05，圖2B）。

圖2 各組小鼠紋狀體TH陽(yáng)性纖維表達(dá)Figure 2.Striatal TH Positive Fiber Expression in Each Group

對(duì)D2-Cre 小鼠轉(zhuǎn)染興奮性光敏感蛋白病毒（rAAVEf1α-DIO-ChR2-EYFP-WPRE-pA）共聚焦掃描結(jié)果顯示，在綠色激發(fā)光下，D2-Cre 小鼠紋狀體D2-MSN 出現(xiàn)明顯綠色熒光（圖3B）；通過給予腦片藍(lán)光刺激，在膜片鉗顯示器中可以觀察到明顯反應(yīng)（圖3C）。表明，將興奮性光敏感蛋白病毒成功轉(zhuǎn)染至紋狀體D2-MSN。

圖3 紋狀體光敏感蛋白轉(zhuǎn)染情況Figure 3.Optogenetic Viral Expression in Str

2.2 光刺激PD 模型小鼠紋狀體D2-MSN 對(duì)D1-MSN 動(dòng)作電位發(fā)放的影響

采用全細(xì)胞膜片鉗結(jié)合光遺傳技術(shù)，在熒光顯微鏡下特異性區(qū)分D2-MSN 和D1-MSN（圖4A、B），鉗制D1-MSN并注入一系列電流，使其爆發(fā)動(dòng)作電位，D1-MSN 表現(xiàn)出內(nèi)向整流和動(dòng)作電位發(fā)放延遲等MSN 典型的電生理特性（圖4C、D、E）；用473 nm 的藍(lán)色激光刺激視野中心D2-MSN，觀察激活D2-MSN 對(duì)D1-MSN 動(dòng)作電位發(fā)放的影響。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，注入300 pA 電流時(shí)，D1-MSN 動(dòng)作電位發(fā)放個(gè)數(shù)：D2-Cre 組 為15.43±0.88 個(gè)，PDD2-Cre組 為16.33±1.01 個(gè)，PD+ExD2-Cre組為15.97±1.08 個(gè)，各組間無顯著性差異（P＞0.05）。注入300 pA 電流并同時(shí)給予473 nm 的藍(lán)色激光刺激視野中心D2-MSN 時(shí)，D1-MSN 動(dòng)作電位發(fā)放個(gè)數(shù)出現(xiàn)明顯變化，D2-Cre 組為7.1±0.66 個(gè)，PDD2-Cre組為4.11±0.55 個(gè)，顯著低于D2-Cre 組（P＜0.05）；PD+ExD2-Cre組為5.75±0.4 個(gè)，顯著高于PD 組，但低于D2-Cre 組（P＜0.05）（圖4F）。

2.3 D2R 激動(dòng)劑對(duì)PD 模型小鼠D2MSN-D1MSN 抑制性效應(yīng)的影響

D2R 激動(dòng)劑干預(yù)對(duì)光刺激D2-MSN 誘導(dǎo)的D1-MSN oIPSC 的影響，各組小鼠存在一定差異（圖5）。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，D2-Cre 組小鼠紋狀體D1-MSN oIPSC 的幅值與基線的比值為56.25%±2.98%（n=8 cells），PDD2-Cre組小鼠為79.87%±2.68%（n=8 cells），PD+ExD2-Cre組小鼠為71.12%±5.38%（n=8 cells）；PDD2-Cre組小鼠oIPSC 幅值與基線的比值顯著高于D2-Cre 組（P＜0.05），PD+ExD2-Cre組小鼠顯著低于PDD2-Cre組，但高于D2-Cre 組（P＜0.05，圖5D）。

2.4 光刺激D2-MSN 對(duì)PD 模型小鼠紋狀體-黑質(zhì)網(wǎng)狀部抑制性突觸后場(chǎng)電位的影響

采用離體腦片場(chǎng)電位結(jié)合光遺傳技術(shù)，觀察光刺激D2-MSN 誘導(dǎo)各組小鼠SNr 的fIPSP 最大幅值變化情況。結(jié)果顯示，D2-Cre 組fIPSP 最大幅值為1.38±0.12 mV（n=7 slices），PDD2-Cre組fIPSP 最大幅值為1.02±0.17 mV（n=6 slices），PD+ExD2-Cre組fIPSP 最大幅值為1.18±0.07 mV（n=7 slices）；PDD2-Cre組小鼠fIPSP 最大幅值顯著低于D2-Cre 組（P＜0.05），PD+ExD2-Cre組小鼠fIPSP 最大幅值顯著高于PDD2-Cre組，但低于D2-Cre 組（P＜0.05）（圖6C、D）。

3 討論與分析

紋狀體是基底神經(jīng)節(jié)中運(yùn)動(dòng)調(diào)控的重要腦區(qū)，激活紋狀體D1-MSN，調(diào)控直接通路，可易化運(yùn)動(dòng)行為；激活紋狀體D2-MSN，調(diào)控間接通路，則抑制運(yùn)動(dòng)行為。由于D1MSN 和D2MSN 在紋狀體內(nèi)的分布高度重疊，很難依靠其解剖形態(tài)或電生理特性進(jìn)行有效區(qū)分。隨著光遺傳學(xué)技術(shù)的問世，對(duì)D1-MSN 和D2-MSN 神經(jīng)元特異性識(shí)別及操控成為可能（Nagel et al.，2002；Zhang et al.，2007）。利用光遺傳學(xué)、病毒轉(zhuǎn)染等技術(shù)的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，紋狀體相鄰MSN 之間存在旁支突觸結(jié)構(gòu)，稱之為側(cè)抑制突觸；并根據(jù)突觸前后胞體表達(dá)的DA 受體類型分為D2MSND2MSN、D2MSN-D1MSN、D1MSN-D2MSN 及 D1MSND1MSN 4 種突觸連接方式。側(cè)抑制突觸不僅對(duì)突觸后神經(jīng)元產(chǎn)生側(cè)抑制效應(yīng)，還可對(duì)突觸前神經(jīng)元產(chǎn)生前饋抑制，進(jìn)而調(diào)節(jié)直接或間接通路的活性。

圖4 光刺激前后各組小鼠D1-MSN的動(dòng)作電位發(fā)放情況Figure 4.The APs of D1-MSN before and after Optogenetic Stimulation in Each Group

3.1 運(yùn)動(dòng)降低PD模型小鼠D2MSN-D1MSN側(cè)抑制效應(yīng)

光遺傳結(jié)合全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)已運(yùn)用于PD 病理機(jī)制的研究中。Cui 等（2013）利用光遺傳學(xué)技術(shù)興奮小鼠紋狀體的D2-MSN，成功使小鼠表現(xiàn)出PD 類似的行為功能障礙。Dobbs 等（2016）采用光遺傳技術(shù)激活表達(dá)有ChR2的小鼠D2-MSN，抑制了D1-MSN 興奮性，初步證實(shí)在紋狀體MSN 之間存在側(cè)抑制效應(yīng)，并可能參與直接/間接通路信號(hào)調(diào)控的假說。Taverna 等（2008）觀察到PD 小鼠模型存在MSN 側(cè)抑制突觸連接減弱的現(xiàn)象，且這種現(xiàn)象主要發(fā)生在D2-MSN。Wei 等（2017）進(jìn)一步使用膜片鉗配對(duì)記錄的方法研究發(fā)現(xiàn)，PD 病理狀態(tài)下D2-MSN 側(cè)抑制突觸的IPSC 幅值升高，側(cè)抑制效應(yīng)發(fā)生異常。本實(shí)驗(yàn)中對(duì)D2-Cre 小鼠轉(zhuǎn)染興奮性光敏感蛋白病毒（rAAV-Ef1α-DIOChR2-EYFP-WPRE-pA），通過473 nm 藍(lán)光刺激D2-MSN，發(fā)現(xiàn)各組小鼠相鄰D1-MSN 動(dòng)作電位發(fā)放頻率和數(shù)量均顯著降低，證實(shí)D2-MSN 與相鄰D1-MSN 存在側(cè)抑制效應(yīng)；且PD 組小鼠側(cè)抑制突觸的oIPSC 幅值顯著升高，側(cè)抑制效應(yīng)發(fā)生異常，與Wei 等（2017）研究結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)中，PD+ExD2-Cre組小鼠在給予D2-MSN 473 nm 藍(lán)光刺激后相鄰D1-MSN 動(dòng)作電位發(fā)放數(shù)量顯著高于PD 組，但低于D2-Cre 組，表明運(yùn)動(dòng)干預(yù)減弱了PD 小鼠紋狀體D2MSND1MSN 的側(cè)抑制效應(yīng)，其機(jī)制可能與運(yùn)動(dòng)改善了PD 小鼠皮層-紋狀體突觸傳遞異常，降低了D2-MSN 的興奮性，減少了側(cè)抑制突觸前GABA 的釋放有關(guān)（趙剛 等，2019b）。本實(shí)驗(yàn)室前期研究已經(jīng)證實(shí)，運(yùn)動(dòng)干預(yù)可選擇性逆轉(zhuǎn)PD動(dòng)物D2-MSN 的樹突棘丟失，使紋狀體突觸結(jié)構(gòu)發(fā)生運(yùn)動(dòng)依賴性重塑（陳平，2018），這一結(jié)果也為運(yùn)動(dòng)改善D2MSN-D1MSN 側(cè)抑制效應(yīng)提供了神經(jīng)解剖學(xué)基礎(chǔ)。

圖5 D2R激動(dòng)劑干預(yù)對(duì)紋狀體D2MSN-D1MSN oIPSC的影響Figure 5.The Effect of D2R Agonist on D2MSN-D1MSN oIPSC

圖6 光刺激D2-MSN對(duì)SNr的fIPSP最大幅值的影響Figure 6.The Effect of Optogenetic Stimulation D2-MSN on SNr fIPSP

3.2 D2R 在運(yùn)動(dòng)改善PD 模型小鼠D2MSN-D1MSN 側(cè)抑制效應(yīng)中的作用

紋狀體D2MSN-D1MSN 側(cè)抑制效應(yīng)的強(qiáng)弱可由突觸前與突觸后兩條途徑調(diào)節(jié)。DA 受體主要參與側(cè)抑制突觸前神經(jīng)元興奮性的調(diào)節(jié)。當(dāng)突觸前MSN 細(xì)胞膜上D1R激活時(shí)，胞體內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（Cyclic Adenosine monophosphate，cAMP）水平上調(diào)，進(jìn)而增加蛋白激酶A 水平，從而增強(qiáng)G 蛋白耦聯(lián)受體活性，使更多GABA 進(jìn)入囊泡釋放至突觸間隙；相反，當(dāng)突觸前MSN 細(xì)胞膜上D2R 激活時(shí)，胞體內(nèi)cAMP 水平下調(diào)，減少GABA 的釋放。Lalchandani等（2013）利用光遺傳技術(shù)將ChR2 轉(zhuǎn)染在小鼠D2-MSN，發(fā)現(xiàn)給予D2R 激動(dòng)劑Quin 干預(yù)可減弱光刺激D2-MSN 對(duì)D1-MSN 的IPSCs，但不影響間接通路中接受D2-MSN 投射的蒼白球外側(cè)部（external segment of globus pallidus，GPe）神經(jīng)元的IPSCs。本實(shí)驗(yàn)中，通過給予D2R 激動(dòng)劑Quin 抑制突觸前D2-MSN 胞體的興奮性，顯著降低D2MSN-D1MSN 側(cè)抑制效應(yīng)。提示，D2R 通過降低D2-MSN 興奮 性 減 少GABA 釋放，調(diào)節(jié)D2MSN-D1MSN 側(cè)抑制效應(yīng)。

目前，有關(guān)運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)PD 小鼠紋狀體側(cè)抑制效應(yīng)影響的研究鮮見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用光遺傳、藥理學(xué)結(jié)合離體腦片膜片鉗技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，給予D2R 激動(dòng)劑Quin干預(yù)后，光刺激D2-MSN 誘導(dǎo)的D1-MSN oIPSC，PD+ExD2-Cre組小鼠顯著低于PD 組，表明D2R 在運(yùn)動(dòng)改善紋狀體D2MSN-D1MSN 側(cè)抑制效應(yīng)的調(diào)節(jié)中具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究證實(shí)，運(yùn)動(dòng)的神經(jīng)保護(hù)作用可上調(diào)紋狀體D2R 表達(dá)水平（王弘，2016），抑制PD 動(dòng)物D2-MSN的興奮性。由此推測(cè)，運(yùn)動(dòng)干預(yù)減弱PD 小鼠紋狀體D2MSN-D1MSN 側(cè)抑制效應(yīng)異常與側(cè)抑制突觸前膜D2R功能改變有關(guān)，D2R 可能是D2MSN-D1MSN 側(cè)抑制效應(yīng)調(diào)節(jié)的重要細(xì)胞分子。

3.3 運(yùn)動(dòng)通過改善PD 模型小鼠D2MSN-D1MSN 側(cè)抑制效應(yīng)調(diào)節(jié)SNr 信號(hào)輸出

SNr 是基底神經(jīng)節(jié)直接與間接通路最終信息整合與輸出的核團(tuán)之一，可接收多種興奮或抑制性神經(jīng)投射。神經(jīng)解剖學(xué)研究證實(shí)，紋狀體MSN 之間不僅存在短側(cè)支突觸連接，還有長(zhǎng)距離軸突投射至SNr。Schmidt 等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，無論是否成功停止動(dòng)作，丘腦底核（subthalamicnucleus，STN）神經(jīng)元都出現(xiàn)較高的興奮性，但只有當(dāng)真正成功停止動(dòng)作時(shí)，SNr 神經(jīng)元才會(huì)出現(xiàn)較高的興奮性，表明快速反應(yīng)動(dòng)作終止需要側(cè)抑制效應(yīng)參與。此外，Gulley 等（2002）發(fā)現(xiàn)，大鼠的SNr 會(huì)在抑制性行為的開始階段出現(xiàn)放電頻率降低，而此時(shí)直接通路其他核團(tuán)的神經(jīng)元仍處于興奮狀態(tài)。提示，來自紋狀體D2MSND1MSN 的側(cè)抑制效應(yīng)可能也參與SNr 信息輸出的調(diào)節(jié)。

本研究中向ACSF 中加入CNQX（10 μM）及AP5（50 μM），阻斷Glu 介導(dǎo)的興奮性電流，在SNr 記錄到的fIPSP主要為紋狀體D1-MSN GABA 能神經(jīng)元介導(dǎo)。研究結(jié)果表明，光刺激紋狀體D2-MSNPD，SNr 的fIPSP 最大幅值顯著降低，與前一實(shí)驗(yàn)PD 組小鼠D1-MSN oIPSC 幅值升高相對(duì)應(yīng)。提示，PD 病理狀態(tài)下D2MSN-D1MSN 側(cè)抑制效應(yīng)增強(qiáng)對(duì)SNr 信息輸出產(chǎn)生抑制作用。4 周運(yùn)動(dòng)干預(yù)增強(qiáng)了PD 小鼠SNr 的fIPSP 最大幅值，可能與運(yùn)動(dòng)降低D2MSN-D1MSN 側(cè)抑制效應(yīng)，提高D1-MSN 的興奮性，加強(qiáng)了SNr 的信息輸出有關(guān)。

側(cè)抑制效應(yīng)對(duì)基底神經(jīng)節(jié)輸出核團(tuán)的調(diào)控機(jī)制仍存在爭(zhēng)議。有學(xué)者認(rèn)為，來自皮層的信息經(jīng)過紋狀體MSN處理后，大部分沿直接與間接通路投射至蒼白球內(nèi)側(cè)部/黑質(zhì)網(wǎng)狀部復(fù)合體（GPi/SNr），此時(shí)相鄰MSN 通過側(cè)抑制效應(yīng)對(duì)部分信息進(jìn)行調(diào)節(jié)，并沿軸突投射傳至GPi/SNr；生理狀態(tài)下，GPi/SNr 通過以上兩種方式接收的興奮/抑制信息輸出具有較高的對(duì)比度，可將清晰的信息反饋回皮層精確調(diào)控運(yùn)動(dòng)（Wei et al.，2017，圖7）。本研究認(rèn)為，PD病理狀態(tài)下，紋狀體DA 投射減少，D2R 表達(dá)下調(diào)及出現(xiàn)超敏，MSN 側(cè)抑制突觸前膜GABA 釋放減少，側(cè)抑制效應(yīng)異常，此時(shí)GPi/SNr 接收的興奮與抑制信息輸出的對(duì)比度降低，無法向皮層精確反饋動(dòng)作信息，引起運(yùn)動(dòng)功能障礙。運(yùn)動(dòng)可能通過上調(diào)D2R 表達(dá)，改善D2MSN-D1MSN側(cè)抑制效應(yīng)，加強(qiáng)GPi/SNr 興奮與抑制信息輸出的對(duì)比度，提高向皮層反饋動(dòng)作信息的精確性，改善PD 運(yùn)動(dòng)功能障礙。

圖7 D2MSN-D1MSN側(cè)抑制效應(yīng)對(duì)SNr信號(hào)輸出的調(diào)節(jié)Figure 7.The Adjustment Diagram of D2MSN-D1MSN Lateral Inhibition on SNr Signal Output

4 結(jié)論

PD 小鼠紋狀體D2MSN-D1MSN 側(cè)抑制效應(yīng)異常，并影響了SNr 的信息輸出，這可能是導(dǎo)致PD 基底神經(jīng)節(jié)功能紊亂的重要原因之一。4 周運(yùn)動(dòng)干預(yù)通過改善PD 小鼠紋狀體D2MSN-D1MSN 側(cè)抑制效應(yīng)，調(diào)節(jié)了SNr 的信息輸出。D2R 在運(yùn)動(dòng)改善PD 小鼠紋狀體D2MSN-D1MSN 側(cè)抑制效應(yīng)調(diào)節(jié)基底神經(jīng)節(jié)信息輸出中起重要作用。