鹽酸利多卡因眼用凝膠在兔眼房水中藥物濃度測(cè)定及藥動(dòng)學(xué)研究

劉冰，徐曉文，林宏達(dá)，孫成龍，丁黎*，尤淋君

中國(guó)藥科大學(xué) 1藥物分析教研室；2新藥安全評(píng)價(jià)研究中心，南京 210009

鹽酸利多卡因眼用凝膠在兔眼房水中藥物濃度測(cè)定及藥動(dòng)學(xué)研究

劉冰1，徐曉文1，林宏達(dá)1，孫成龍1，丁黎1*，尤淋君2

中國(guó)藥科大學(xué)1藥物分析教研室；2新藥安全評(píng)價(jià)研究中心，南京 210009

目的：建立兔眼房水中利多卡因的LC-MS/MS檢測(cè)方法，研究鹽酸利多卡因眼用凝膠在兔眼房水中的藥動(dòng)學(xué)特征。方法：72只雄性新西蘭兔分成Ⅰ和Ⅱ兩組，每組36只，Ⅰ和Ⅱ組分別給予鹽酸利多卡因眼用凝膠受試制劑和參比制劑，左右眼均滴入15 μL，于不同時(shí)間點(diǎn)取房水樣品，經(jīng)沉淀蛋白后，采用LC-MS/MS法測(cè)定房水中的利多卡因。以來(lái)曲唑?yàn)閮?nèi)標(biāo)，采用Hanbon Hedera ODS-2 C18（2.1 mm×150 mm，5 μm）色譜柱，流動(dòng)相為甲醇-20 mmol·L-1醋酸銨水溶液（含0.1%甲酸）（55∶45，v/v），質(zhì)譜采用氣動(dòng)輔助電噴霧離子化和正離子多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)。結(jié)果：利多卡因房水濃度在2.070～10350 ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.9995）。單次給予新西蘭兔受試制劑和參比制劑后，房水中利多卡因的Cmax分別為（10193±4535）ng·mL-1和（11046± 2734）ng·mL-1，AUC0-8分別為7582 ng·h·mL-1和8125 ng·h·mL-1，t1/2分別為2.6 h和1.9 h，Tmax均為0.3 h。結(jié)論：鹽酸利多卡因眼用凝膠受試和參比制劑在房水中藥動(dòng)學(xué)特征一致，眼部給藥后利多卡因可快速穿透角膜到達(dá)房水，并在房水中達(dá)到較高的濃度。

利多卡因；眼用凝膠；房水；藥代動(dòng)力學(xué)；新西蘭兔；LC-MS/MS

鹽酸利多卡因是一種酰胺類局部麻醉藥，被廣泛用于浸潤(rùn)麻醉、硬膜外麻醉、表面麻醉及神經(jīng)傳導(dǎo)阻滯。國(guó)內(nèi)眼科手術(shù)多使用2%鹽酸利多卡因注射液，目前尚未見專為眼表面麻醉設(shè)計(jì)的鹽酸利多卡因滴眼液或其他劑型。鹽酸利多卡因眼用凝膠可延長(zhǎng)藥物與眼表面接觸時(shí)間，改善麻醉效果，減少藥物全身吸收，因此用于眼科操作表面麻醉安全、有效[1-2]。然而，關(guān)于鹽酸利多卡因眼部藥代動(dòng)力學(xué)的研究在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中尚未報(bào)道過(guò)，為研究鹽酸利多卡因眼用凝膠的眼部藥代動(dòng)力學(xué)特征，本試驗(yàn)建立了LC-MS/MS法測(cè)定兔眼房水中利多卡因的濃度。

文獻(xiàn)報(bào)道檢測(cè)利多卡因濃度的方法為HPLC法[3]、高效毛細(xì)管電泳法[4]、氣相色譜-質(zhì)譜法[5]，這些方法靈敏度不高，難以滿足微量濃度的檢測(cè)。有文獻(xiàn)報(bào)道采用LC-MS/MS法測(cè)定利多卡因[6-7]，但樣品處理常用液液萃取，過(guò)程相對(duì)復(fù)雜。本試驗(yàn)建立的LC-MS/MS法簡(jiǎn)化了樣品的前處理過(guò)程，靈敏度高，重現(xiàn)性好，符合生物樣品的分析要求。

1 材料

1.1 儀器

Agilent Technologies 6410 Triple Quad LC/MS系統(tǒng)和MassHunter Workstation Software工作站（美國(guó)Agilent公司）；Satorious電子分析天平（德國(guó)賽多利斯股份有限公司）；HC-2062型臺(tái)式高速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；CM-1000高速振蕩機(jī)（日本東京理化器械株式會(huì)社）。

1.2 藥品與試劑

鹽酸利多卡因眼用凝膠（受試制劑，濟(jì)南百諾醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司，批號(hào)：20131001，規(guī)格：5 mL∶0.175 g）；鹽酸利多卡因眼用凝膠（參比制劑，AktenTM，Akorn Inc，批號(hào)：421213，規(guī)格：35 mg·mL-1）；利多卡因?qū)φ掌罚ㄖ袊?guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100342-201003，純度99.9%）；來(lái)曲唑?qū)φ掌罚ㄖ袊?guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：101045-201101，純度100.0%）；甲醇、乙腈（色譜純，美國(guó)Merck公司）；其余試劑為市售分析純；實(shí)驗(yàn)用水為純凈水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇72只健康新西蘭兔，體重2.0～2.5 kg，均為雄兔，無(wú)眼疾，由南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK（蘇）2012-0008。本研究的動(dòng)物飼養(yǎng)、給藥以及生物樣本的采集在中國(guó)藥科大學(xué)新藥安全評(píng)價(jià)研究中心進(jìn)行（動(dòng)物使用合格證號(hào)：0022144）。

2 方法

2.1 色譜條件和質(zhì)譜條件

色譜柱：Hedera ODS-2 C18（2.1 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-20 mmol·L-1醋酸銨水溶液（含0.1%甲酸）55∶45；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：5 μL。

離子檢測(cè)方式：多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；離子極性：正離子（Positive）；離子化方式：電噴霧離子化（ESI）；用于定量分析的離子分別為：利多卡因m/z 235.1→86.1和內(nèi)標(biāo)（來(lái)曲唑）m/z 286.2→217.1；傳輸區(qū)電壓：115 V和115 V；碰撞能量：15 eV和8 eV；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流速：10 L·min-1；霧化室壓力：40 psi。

2.2 樣品的采集與處理

將72只雄性新西蘭兔隨機(jī)分成Ⅰ組和Ⅱ組，每組各36只，再將每組內(nèi)的36只動(dòng)物隨機(jī)分成12組，每組3只（6只眼睛），每組對(duì)應(yīng)一個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)。給藥前均需禁食12～24 h，Ⅰ組給予受試制劑，Ⅱ組給予參比制劑，左右眼均滴入15 μL藥液，分別于給藥前及給藥后5、10、20、40 min，1、1.5、2、3、4、6、8 h用頭皮針刺穿角膜，抽取約200 μL房水，于-20℃冰箱中密封保存。

取20 μL房水樣品，加入內(nèi)標(biāo)（來(lái)曲唑）溶液20 μL（15.48 μg·mL-1），渦旋混勻，再加入1 mL流動(dòng)相（甲醇∶水=50∶50），渦旋3 min，于15600 r·min-1高速離心5 min，取上清液5 μL進(jìn)行LC-MS/MS分析。

2.3 數(shù)據(jù)處理

通過(guò)計(jì)算房水在同一采樣時(shí)間點(diǎn)的所有樣本濃度的平均值，得平均藥物濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)，采用DAS 2.0軟件估算房水中利多卡因的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 分析方法驗(yàn)證

3.1.1 方法專屬性在“2.1”項(xiàng)下的色譜和質(zhì)譜條件下，利多卡因的保留時(shí)間為1.8 min左右，內(nèi)標(biāo)（來(lái)曲唑）的保留時(shí)間為3.0 min左右。由圖1可見，利多卡因和內(nèi)標(biāo)峰形良好，房水中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測(cè)定。

圖1 專屬性色譜圖

3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線取1.5 mL塑料離心管數(shù)支，分別精密加入利多卡因標(biāo)準(zhǔn)溶液，以氮?dú)饬鞔蹈?，加入空白房?0 μL，渦旋混勻，配成含利多卡因的濃度為2.070、6.210、20.70、62.10、207.0、621.0、2070、6210、10350 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)含藥房水，按“2.2”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣，記錄色譜圖。計(jì)算利多卡因峰面積As和內(nèi)標(biāo)峰面積Ai的比值f（As/Ai），以f對(duì)藥物濃度C作權(quán)重回歸計(jì)算，權(quán)重系數(shù)w=1/C2，得回歸方程，典型的利多卡因權(quán)重回歸方程為：f=0.002357×C+ 0.001363，r2=0.9995。結(jié)果顯示，房水中利多卡因濃度在2.070～10350 ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低定量限為2.070 ng·mL-1，信噪比大于10。

3.1.3 精密度和準(zhǔn)確度依“3.1.2”方法配制含利多卡因濃度分別為2.070、4.140、310.5、8280 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)含藥房水，每個(gè)濃度平行5份，并制備隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，按“2.2”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)測(cè)定3批。將所測(cè)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，計(jì)算精密度（RSD）和準(zhǔn)確度，結(jié)果見表1。本方法的準(zhǔn)確度與精密度符合生物樣品分析要求。

3.1.4 基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率依文獻(xiàn)方法[8-9]考察低、中、高3種濃度（含利多卡因的濃度為4.140、310.5、8280 ng·mL-1）的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率，結(jié)果見表1。房水中內(nèi)標(biāo)來(lái)曲唑的回收率為（100.6± 1.4）%（n=15），基質(zhì)效應(yīng)為（98.2±3.0）%（n=18）。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)條件下利多卡因和內(nèi)標(biāo)的回收率均良好，房水基質(zhì)對(duì)其離子化無(wú)影響。

表1 精密度、準(zhǔn)確度、回收率（n=5）和基質(zhì)效應(yīng)（n=6）試驗(yàn)結(jié)果

3.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)以4.140、310.5、8280 ng·mL-13種濃度考察利多卡因標(biāo)準(zhǔn)含藥房水的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，利多卡因房水樣品在室溫下放置16.5 h，反復(fù)3次凍融及-20℃冰凍21天條件下均穩(wěn)定性良好；房水樣品處理后的上清液在進(jìn)樣器中放置18 h穩(wěn)定性良好。

3.1.6 稀釋準(zhǔn)確度試驗(yàn)依“3.1.2”項(xiàng)配制含利多卡因濃度分別為11154、20280 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)含藥房水，每個(gè)濃度平行5份，在上述配制好的含藥房水中加入空白房水稀釋5倍，按“2.2”項(xiàng)下方法處理后測(cè)定，計(jì)算準(zhǔn)確度，濃度為11154、20280 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)含藥房水稀釋5倍后的準(zhǔn)確度分別為（93.3± 1.5）%和（100.4±0.8）%，表明稀釋準(zhǔn)確度良好。

3.2 藥代動(dòng)力學(xué)研究

新西蘭兔眼部（左右眼均給藥）分別給予15 μL（35 mg·mL-1）受試制劑和參比制劑后，計(jì)算房水在同一采樣時(shí)間點(diǎn)的所有樣本濃度的平均值，得平均藥物濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)，由此估算房水中利多卡因的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表2、圖2。比較受試和參比制劑在新西蘭兔房水中的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，結(jié)果表明，兩制劑在新西蘭兔房水中的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)AUC0-8、AUC0-∞、Cmax、t1/2、Tmax、MRT0-8、CL、Vd基本一致，因此可以判定：兩制劑在新西蘭兔房水中的藥動(dòng)學(xué)特征是一致的。

4 討論

本試驗(yàn)所建立的LC-MS/MS法樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單，靈敏度高，快速，重現(xiàn)性、專屬性好，能適用于新西蘭兔給予鹽酸利多卡因眼用凝膠后房水中藥代動(dòng)力學(xué)的研究。

利多卡因結(jié)構(gòu)中含有酰胺基團(tuán)和叔胺基，呈堿性，在流動(dòng)相中加入適當(dāng)?shù)奶砑觿┛梢愿淖兇郎y(cè)物的保留時(shí)間，改善峰形。試驗(yàn)比較了水相中加酸與不加酸條件下，待測(cè)物的色譜行為：不加酸情況下，待測(cè)物保留較強(qiáng)，出峰時(shí)間在9 min左右，且峰拖尾嚴(yán)重；加酸條件下，待測(cè)物保留減弱，出峰時(shí)間僅1.8 min，且峰形對(duì)稱，響應(yīng)增大。原因可能是利多卡因易與色譜柱上殘存的硅醇基產(chǎn)生作用，從而導(dǎo)致保留增強(qiáng)，峰形拖尾。加酸可以抑制硅醇基的電離，對(duì)堿性化合物的保留和峰形均能起到改善作用。同時(shí)，試驗(yàn)還比較了水相中加入甲酸和乙酸條件下，待測(cè)物的色譜行為。不同的酸對(duì)利多卡因在色譜柱上的保留無(wú)影響，但甲酸可使峰形更為尖銳對(duì)稱。加入醋酸銨可以穩(wěn)定水相的pH，對(duì)峰形也具有改善作用[10]。

表2 新西蘭兔眼部分別給予15 μL（35 mg·mL-1）受試制劑和參比制劑后房水中利多卡因的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)（n=6）

圖2 新西蘭兔眼部分別給予受試和參比制劑后房水中利多卡因平均濃度-時(shí)間曲線（n=6）

兔為眼用制劑研究的首選動(dòng)物，兔眼與人眼大小、結(jié)構(gòu)相近，因此選用新西蘭兔作為眼部藥動(dòng)學(xué)的試驗(yàn)對(duì)象。房水能夠較客觀地反映藥物在眼內(nèi)的濃度變化，且在提取時(shí)一般能夠準(zhǔn)確定量，由實(shí)驗(yàn)操作產(chǎn)生的誤差較小，故本試驗(yàn)選房水作為眼部藥動(dòng)學(xué)研究的考察樣品[11-13]。

鹽酸利多卡因眼用凝膠說(shuō)明書中的人用推薦劑量是2滴（100 μL），通過(guò)劑量換算，確定本試驗(yàn)的給藥劑量為15 μL，因此其藥動(dòng)學(xué)參數(shù)可以為臨床用藥提供參考依據(jù)。

新西蘭兔眼部給予鹽酸利多卡因眼用凝膠后，5 min即可在房水中測(cè)得利多卡因，8 h仍可檢測(cè)得到，且在兔眼房水中藥物濃度較高。結(jié)果表明，鹽酸利多卡因眼用凝膠易被眼組織迅速吸收，且維持時(shí)間較長(zhǎng)，在兔眼房水中具有良好的藥動(dòng)學(xué)特征和組織通透性，適合用于眼科操作的表面麻醉，值得臨床推廣應(yīng)用。

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Determination and Pharmacokinetics of Lidocaine in Aqueous Humor after Ocular Administration of Lidocaine Hydrochloride Ophthalmic Gel to Rabbits

LIU Bing1,XU Xiao-wen1,LIN Hong-da1,SUN Cheng-long1,DING Li1*,YOU Lin-jun2
1Department of Pharmaceutical Analysis;2Centre for New Drug Safety Evaluation and Research,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009,China

Objective：To establish an LC-MS/MS method for the determination of lidocaine in ocular aqueous humor of rabbit and to study the pharmacokinetics of lidocaine hydrochloride ophthalmic gel after a single topical ocular administration.Methods：Seventy-two rabbits were placed in two groups based on the test and reference formulations.Rabbits in each group were instilled with a single 15 μL of lidocaine hydrochloride ophthalmic gel into each eye.Following the sample collection and deproteinization procedures, the lidocaine concentrations in aqueous humor were determined by LC-MS/MS.Letrozole was used as the internal standard and the chromatographic separation was achieved on a Hedara ODS-2 column(5 μm,150 mm×2.1 mm i.d.)with a mobile phase of methanol-0.1%formic acid water solution with 20 mmol·L-1ammonium acetate(55∶45,V/V).The detection was performed using the electrospray ionization(ESI)operating in the positive ion multiple reaction monitoring(MRM)mode.Results：The method demonstrated good linearity ranged from 2.070 to 10350 ng·mL-1with r=0.9995.After administration of the test and reference formulation to the rabbits,the Cmaxvalues were(10193±4535)ng·mL-1and(11046±2734)ng·mL-1,respectively,the AUC0-8values were 7582 ng·h·mL-1and 8125 ng·h·mL-1,respectively,the t1/2values were 2.6 h and 1.9 h, respectively,and the Tmax values were both 0.3 h.Conclusion：There was no significant difference of pharmacokinetic characteristics between the two formulations.Lidocaine hydrochloride ophthalmic gel could rapidly achieve a high concentration in aqueous humor after its topical ocular administration to rabbits.

Lidocaine;Ophthalmic gel;Aqueous humor;Pharmacokinetics;New Zealand rabbits;LCMS/MS

R969.1

A

1673-7806（2014）03-201-04

劉冰，女，碩士生 E-mail:liubing19881027@163.com

*通訊作者 丁黎，男，博士生導(dǎo)師、教授 Tel:025-83271485

E-mail:dinglidl@sina.com

2014-03-18

2014-04-09