小鼠單核巨噬白血病細(xì)胞培養(yǎng)條件優(yōu)化

摘要：目的探討小鼠單核巨噬白血病細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)方法。方法采用胰酶消化和細(xì)胞刮棒的方法獲得細(xì)胞最適的傳代方法，比較培養(yǎng)基酸堿度、培養(yǎng)耗材等確定最佳培養(yǎng)條件。結(jié)果采用細(xì)胞刮棒方法，沿著細(xì)胞培養(yǎng)瓶一端順勢往另一端輕柔刮取細(xì)胞比胰酶消化法獲得的細(xì)胞傳代，對細(xì)胞的損傷更小，細(xì)胞狀態(tài)更好，在所有細(xì)胞培養(yǎng)條件中，培養(yǎng)耗材的高壓滅菌和培養(yǎng)基的酸堿度對細(xì)胞的影響最大，在培養(yǎng)過程中需要采取180℃高壓滅菌和調(diào)節(jié)酸堿度來獲得細(xì)胞的最佳狀態(tài)。結(jié)論采用DMEM高唐培養(yǎng)基+10%FBS，細(xì)胞刮棒沿著一個方向輕輕刮取細(xì)胞，傳代的比例最佳為1∶4，采用過濾的HEPES每次實驗時調(diào)節(jié)培養(yǎng)基酸堿度，是細(xì)胞的最佳培養(yǎng)條件。

關(guān)鍵詞：小鼠單核巨噬白血病細(xì)胞；細(xì)胞刮棒；高壓滅菌；酸堿度

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是目前很多醫(yī)學(xué)研究離不開的技術(shù)，腫瘤細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)中占據(jù)核心的地位。腫瘤是對人類威脅最大的疾病之一，是研究癌變機(jī)制和抗癌藥物篩選的重要手段。腫瘤細(xì)胞雖具有無限增殖的特性，但并不表示培養(yǎng)起來很容易，很多因素都會影響到細(xì)胞的形態(tài)及功能。如：酸堿度、CO2濃度、環(huán)境溫度等。小鼠單核巨噬白血病細(xì)胞（RAW264.7）是炎癥研究中非常常見的研究對象，炎癥是伴隨多種疾病的并發(fā)癥，因此越來越受到重視。本文根據(jù)實踐經(jīng)驗，總結(jié)RAW264.7細(xì)胞在培養(yǎng)過程中的生活特性及影響因素，為細(xì)胞科研工作提幫助。

1 RAW264.7細(xì)胞研究

RAW264.7細(xì)胞是小鼠源性破骨前體細(xì)胞，該細(xì)胞株由Raschke WC等建立。它來自Abelson小鼠白血病病毒所致的腫瘤[1]。據(jù)知網(wǎng)上不完全統(tǒng)計，可以發(fā)現(xiàn)我國從1986年就已經(jīng)有對 RAW264.7細(xì)胞的研究了[2]，至2014年共有2700余篇，截止2013年其研究趨勢，見圖1，可見RAW264.7細(xì)胞研究越來越受到重視，因此對于RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)需一個規(guī)范化的標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 RAW264.7細(xì)胞研究趨勢

2 RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)

RAW264.7是破骨前體細(xì)胞，因此在培養(yǎng)過程中很容易分化形成破骨細(xì)胞，另外 RAW264.7細(xì)胞也是一種巨噬細(xì)胞，具有很強(qiáng)的黏附和吞噬抗原的能力，很容易將外界環(huán)境中抗原吞噬，而發(fā)生分化，出現(xiàn)偽足現(xiàn)象，這是困擾科研工作者的一個難題。因此對RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)也是一個很長時間摸索的過程。正常的RAW264.7細(xì)胞是圓形透亮的，而分化之后很容易產(chǎn)生觸角，此時細(xì)胞已經(jīng)在功能上發(fā)生改變，進(jìn)而影響實驗結(jié)果。在我國很多細(xì)胞庫給購買者的建議是用0.25%的胰酶消化，因此我們采取了用0.25%的胰酶消化法來進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)用一般的胰酶配制的0.25%的胰酶可以很快的將細(xì)胞消化下來，但是對細(xì)胞的損傷很大，細(xì)胞傳代之后在培養(yǎng)瓶中很難貼壁，很少貼壁的細(xì)胞，細(xì)胞棱廓也變得模糊不清，細(xì)胞再也很難恢復(fù)之前的狀態(tài)。根據(jù)很多培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞的科研工作者的經(jīng)驗，認(rèn)為RAW264.7細(xì)胞很難用0.25%的胰酶消化這一說法，一直困惑著我們。提示這種反差的現(xiàn)象也許跟胰酶的純度有關(guān)。于是我們改用細(xì)胞刮棒的方法進(jìn)行傳代，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)損傷較小，細(xì)胞在傳代2~4 h內(nèi)基本貼壁，且細(xì)胞狀態(tài)完好。具體方法是沿著細(xì)胞壁的一端順勢往另一端刮，力度要輕柔，能夠?qū)⒓?xì)胞刮掉即可。這里強(qiáng)調(diào)一定要輕，細(xì)胞是個很脆弱的個體，力度過大對細(xì)胞會造成物理損傷，嚴(yán)重時不能恢復(fù)其正常形態(tài)。對于RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基很多經(jīng)驗者建議使用1640，中科院上海細(xì)胞庫則建議使用DMEM高糖培養(yǎng)基，胎牛血清可使用GIBCO胎牛血清，也可使用國產(chǎn)杭州四季清。因此我們對培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）的使用進(jìn)行了正交實驗，研究發(fā)現(xiàn)DMEM高糖培養(yǎng)基與GIBCO胎牛血清培養(yǎng)的細(xì)胞狀態(tài)最好，但對于資金短缺的科研工作者也可以使用DMEM高糖培養(yǎng)基與國產(chǎn)杭州四季清進(jìn)行培養(yǎng)，1640則需與GBICO胎牛血清配合使用，這樣才能保證細(xì)胞狀態(tài)圓而透亮。關(guān)于FBS是否滅活則需要根據(jù)你所買的FBS是否含有對細(xì)胞刺激較大的抗原決定，如有些杭州四季清含有低內(nèi)毒素，內(nèi)毒素是引起巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的激動劑[3]，此時我們則需滅活，因此在購買血清時應(yīng)盡量避免含有這類抗原的血清。血清購買回來需及時分裝，分裝需在無菌條件下操作，然后置于-20℃保存。下面根據(jù)對RAW264.7培養(yǎng)研究，將細(xì)胞復(fù)蘇，細(xì)胞傳代以及細(xì)胞凍存的要點歸納如下。

2.1細(xì)胞復(fù)蘇 從液氮罐中取出凍存管，迅速將凍存管放到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋（37℃）中迅速解凍，不斷的搖動，待凍存管內(nèi)液體完全溶解（控制在1 min內(nèi)），取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內(nèi)，將凍存管內(nèi)的液體轉(zhuǎn)入15 mL離心管，加入2倍體積含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，800 rpm離心3 min，棄去上清液，重懸細(xì)胞，接種到培養(yǎng)瓶中，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，此時重點是細(xì)胞凍存本來就是對細(xì)胞的損傷，需采用的是20%的胎牛血清進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，第二次傳代后換成10%FBS培養(yǎng)。

2.2細(xì)胞傳代 待細(xì)胞長至80%~90%時，從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞，小心吸出培養(yǎng)液，用PBS清洗，加入3 mL 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，用細(xì)胞刮棒沿一個方向輕輕的將細(xì)胞刮下來，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，800 rpm離心3 min，棄去上清液，加入培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，分裝入培養(yǎng)瓶后，放入培養(yǎng)箱37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，因為RAW264.7細(xì)胞的增殖非?？?，因此傳代比例根據(jù)自己實驗需要1∶3~1∶10均可。

2.3細(xì)胞凍存 待細(xì)胞長至80%~90%時，按細(xì)胞傳代方法把細(xì)胞收集起來，將配制好的凍存液加入細(xì)胞中重懸，每管2 mL，凍存液的配制方法是：胎牛血清與二甲基亞砜（DMSO）的比例為9∶1，依次放在4℃中40 min，-20℃中40 min，-80℃中過夜，第2 d轉(zhuǎn)移至液氮灌中保存。

3影響RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)的因素

3.1培養(yǎng)基酸堿度 根據(jù)對RAW264.7的培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)酸堿度對于RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)影響最大，GBICO的DMEM建議在配制過程中加入3.7 g NaHCO3，中科院上海細(xì)胞庫建議加1.5 g NaHCO3，然后用1MHCL調(diào)pH至7.2～7.4，過濾分裝置在4℃冰箱備用。但是在冰箱里放置3 d或1 w后培養(yǎng)基就很容易變紫，但是很多研究者并沒有在意這個問題，仍然用變紫的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，之后細(xì)胞就會出現(xiàn)漂浮或者變成梭形。文獻(xiàn)提示可采用HEPES法進(jìn)行緩沖[4]，我們研究發(fā)現(xiàn)雖然HEPES緩沖能力更強(qiáng)，培養(yǎng)基變堿的時間會延長，但放置時間久后仍然會變紫，通過比較可采用將HEPES配置成母液，過濾并分裝，然后每次傳代的時候用HEPES調(diào)節(jié)培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基調(diào)至所需的pH。

3.2培養(yǎng)耗材 RAW264.7細(xì)胞是一類巨噬細(xì)胞，因此對于接觸細(xì)胞的培養(yǎng)耗材如：槍頭、培養(yǎng)皿等要求需要高一些，研究發(fā)現(xiàn)高溫180℃烘干的耗材比120℃高壓滅菌的耗材培養(yǎng)的細(xì)胞，細(xì)胞的形態(tài)更圓更亮，提示盡量減少抗原有助于RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)，這與方瑤等研究發(fā)現(xiàn)相一致[5]。

4結(jié)論

RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)和研究已然成為一個趨勢，對于RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)也需要標(biāo)準(zhǔn)化的方法，本實驗研究發(fā)現(xiàn)RAW.264.7細(xì)胞的最佳優(yōu)化條件即：DMEM高唐培養(yǎng)基+10%FBS，細(xì)胞刮棒沿著一個方向輕輕刮取細(xì)胞，傳代的比例最佳為1∶4，采用過濾的HEPES每次實驗時調(diào)節(jié)pH。細(xì)胞的培養(yǎng)本身就是一個復(fù)雜的過程，只有細(xì)胞處于最佳狀態(tài)時才能給科研工作者帶來更可靠的實驗結(jié)果，因此對于細(xì)胞的培養(yǎng)，我們更要花耐心和精力去呵護(hù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]肖新華，廖二元，董源媛，等.小鼠單核細(xì)胞RAW264. 7的細(xì)胞生物學(xué)特征[J].南華大學(xué)學(xué)報，2008，36(3):283-285.

[2]汪民.立克次體免疫學(xué)研究的新進(jìn)展[J].中國免疫學(xué)雜志，1986，2(6):376-379.

[3]Bak MJ， Truong VL， Kang HS， Jun M， Jeong WS. Anti-inflammatory effect of procyanidins from wild grape (Vitis amurensis) seeds in LPS-induced RAW 264.7 cells. Oxidative medicine and cellular longevity. 2013;2013: 409321.

[4]Yu-Mi Shin， Hyun-Joo Jung， Woo-Yong Choi，et al.Chang-Jin LimAntioxidative， anti-inflammatory， and matrix metalloproteinase inhibitory activities of 20(S)-ginsenoside Rg3 in cultured mammalian cell lines[J]. Mol Biol Rep (2013) 40:269-279.

[5]方瑤，毛旭虎，等.小鼠巨噬細(xì)胞 RAW264.7 的培養(yǎng)技巧及經(jīng)驗總結(jié)[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，12(22):4358-4359.

編輯/張燕