紅曲菌發(fā)酵豆?jié){生產(chǎn)Monacolin K的研究

馬帥，邵穎，談文詩(shī)，陳濤

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北武漢430070）

紅曲菌發(fā)酵豆?jié){生產(chǎn)Monacolin K的研究

馬帥，邵穎，談文詩(shī)，陳濤*

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北武漢430070）

以豆?jié){為原料，以紅曲菌Monascuspilosus MS-1為菌種生產(chǎn)Monacolin K，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化紅曲菌生產(chǎn)Monacolin K液態(tài)發(fā)酵條件。結(jié)果表明，紅曲菌發(fā)酵豆?jié){生產(chǎn)Monacolin K的優(yōu)化條件為甘油濃度30 g/L，初始pH 6.0，接種量7%，在此條件下，發(fā)酵10 d后Monacolin K產(chǎn)量達(dá)到415.15 mg/L。方差分析表明，甘油對(duì)MonacolinK產(chǎn)量有極顯著的影響，初始pH有顯著影響，接種量無(wú)顯著影響。

紅曲菌；豆?jié){；Monacolin K；條件優(yōu)化

紅曲是經(jīng)紅曲菌發(fā)酵而成的一種藥食兼用的紫紅色米曲［1］。紅曲菌是一種小型腐生真菌，在我國(guó)已有上千年的使用歷史，紅曲菌發(fā)酵能產(chǎn)生多種具有生理活性的次生代謝產(chǎn)物，主要有紅曲色素、Monacolin K、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）［2］。

Monacolin K最早是于1979年由日本學(xué)者遠(yuǎn)騰章教授在紅色紅曲菌中發(fā)現(xiàn)的［3］，其對(duì)羥甲戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶（催化膽固醇合成中的限速步驟）具有強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，從而有效地、特異性地抑制膽固醇的合成。這類(lèi)物質(zhì)濃度達(dá)到0.001 μg/mL～0.005 μg/mL時(shí)就能抑制膽固醇的合成，已經(jīng)在國(guó)內(nèi)外開(kāi)發(fā)了多種Monacolin K藥物制品，是國(guó)際公認(rèn)的理想的降膽固醇和血脂藥物。另外，Monacolin K還具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、抑制皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)后再狹窄、保護(hù)心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞、抗炎和抗癌等作用［4-8］。

大豆含有豐富而優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)、多種不飽和脂肪酸，且氨基酸種類(lèi)齊全，含有人體所需的8種必需氨基酸且含量滿足人體需求，是一種健康食品［9-10］。國(guó)內(nèi)外研究表明，大豆蛋白具有降低高膽固醇血癥患者膽固醇水平的潛在功能，且大豆蛋白本身含有的一些其他組分，如大豆異黃酮和大豆磷脂都證明具有一定的降血脂功效［11-12］。

以大豆為原料制作豆?jié){，然后以豆?jié){為培養(yǎng)基接種紅曲菌生產(chǎn)Monacolin K，通過(guò)液態(tài)發(fā)酵優(yōu)化紅曲菌產(chǎn)Monacolin K的工藝參數(shù)，以提高產(chǎn)品中MonacolinK的產(chǎn)量。得到的紅曲豆?jié){既有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，又有Monacolin K的保健功能，還可能起到大豆蛋白和Monacolin K的協(xié)同降低膽固醇作用。試驗(yàn)使用的菌種Monascus pilosus MS-1經(jīng)分析鑒定不產(chǎn)桔霉素［13］，使用豆?jié){和食品級(jí)試劑作為培養(yǎng)基成分，生產(chǎn)的紅曲豆?jié){可以直接作為功能性食品或原料用于食品及醫(yī)藥領(lǐng)域，避免了有機(jī)溶劑提取等復(fù)雜步驟，符合綠色環(huán)保的要求，具有一定的應(yīng)用前景。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種

Monascus pilosus MS-1：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品生物技術(shù)與安全實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.1.2培養(yǎng)基

菌種活化培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基（馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，加水至1000mL，pH自然）。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖50 g，蛋白胨10 g，MgSO4· 7H2O 0.5 g，NH4H2PO42 g，CaCl20.1 g，定容至1 000 mL，pH 6.0，121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：大豆浸泡12 h，磨漿，調(diào)整豆水比（g/ mL）為1∶9，12層紗布過(guò)濾2次，取濾液，按比例加入碳源，調(diào)節(jié)至適宜pH，制成豆乳原液，121℃滅菌20 min。

1.1.3試劑

洛伐他汀（色譜純）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；甘油（食品級(jí)）：豐益油脂化學(xué)（上海）有限公司；無(wú)水乙醇、磷酸、甲醇，均為分析純：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈（色譜純）：上海珂淮試劑有限公司；飲用純凈水。

1.2儀器與設(shè)備

LC-20A型島津高效液相色譜儀：日本島津公司；Neofuge-18R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：力康發(fā)展有限公司；KQ2200DE型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；HZ200L型恒溫?fù)u床：武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司。

1.3方法

1.3.1紅曲豆?jié){生產(chǎn)主要工藝

大豆挑選→浸泡（豆水比1∶3（g/mL））→磨漿［豆水比1∶9（g/mL）］→過(guò)濾→豆?jié){→加碳源→滅菌→接種紅曲菌→搖瓶發(fā)酵→Monacolin K分析

1.3.2菌種活化

PDA斜面培養(yǎng)基活化紅曲菌，30℃恒溫培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)11 d后備用。

1.3.3種子培養(yǎng)

將活化好的斜面刮至裝有玻璃珠的無(wú)菌生理鹽水中，打散。500 mL三角瓶裝100 mL培養(yǎng)基，5%接種量，30℃，150 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)36 h。

1.3.4分批培養(yǎng)

將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，250 mL三角瓶裝50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)數(shù)天后提取發(fā)酵液中的Monacolin K。

1.3.5單因素試驗(yàn)

以碳源種類(lèi)、碳源濃度、初始pH、接種量進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每個(gè)水平重復(fù)3次，取平均值，分析各單因素對(duì)Monacolin K產(chǎn)生的影響。

1.3.5.1碳源對(duì)Monacolin K的影響

以豆?jié){培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，測(cè)定碳源（濃度20 g/L的葡萄糖、甘油、蔗糖、麥芽糖、乳糖）對(duì)Monacolin K的影響，設(shè)置空白對(duì)照組，接種量5%，初始pH 5.0，25℃，150 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)10 d。

1.3.5.2接種量對(duì)Monacolin K的影響

以豆?jié){培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，加入甘油使?jié)舛葹?0 g/L，測(cè)定不同接種量（4%、5%、6%、7%、8%）對(duì)Monacolin K的影響，初始pH 5.0，25℃，150 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)10 d。

1.3.5.3初始pH對(duì)Monacolin K的影響

以豆?jié){培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，加入甘油使?jié)舛葹?0 g/L，測(cè)定不同初始pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5）對(duì)Monacolin K的影響，接種量7%，25℃，150 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)10 d。

1.3.5.4甘油濃度對(duì)Monacolin K的影響

以豆?jié){培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，測(cè)定甘油濃度（0、5、10、20、30、40 g/L）對(duì)Monacolin K的影響，接種量7%，初始pH5.5，25℃，150 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)10 d。

1.3.6正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選定甘油濃度（A）、初始pH（B）、接種量（C）這3個(gè)因素，采用L9（34）正交表設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以Monacolon K的產(chǎn)量選定最優(yōu)方案，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。試驗(yàn)因素及水平如表1。

表1　正交試驗(yàn)因素水平設(shè)置Table 1　Arrangement of factors and levels in inorthogonal test

1.3.7發(fā)酵液中Monacolin K的測(cè)定［7］

樣品提取：發(fā)酵液過(guò)濾除去菌絲，以V（濾液）∶V（無(wú)水乙醇）=1∶3的比例向?yàn)V液中加入無(wú)水乙醇，混勻后靜置30 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液過(guò)0.22 μm膜后用HPLC分析。

HPLC色譜條件：色譜柱：ZORBAX SB C-18（5 μm，250 mm×4.6 mm）；紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)：238 nm；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。柱溫：30℃；流動(dòng)相：V（乙腈）∶V（純凈水）∶V（0.5%磷酸水溶液）=60∶37∶3。

1.3.8數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)處理進(jìn)行3次重復(fù)，取其平均值進(jìn)行相關(guān)分析。利用數(shù)學(xué)分析軟件SAS V8和Microsoft Excel. 2010進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1不同單因素對(duì)紅曲菌生產(chǎn)Monacolin K的影響

2.1.1不同碳源對(duì)紅曲菌生產(chǎn)Monacolin K的影響

碳源是微生物生長(zhǎng)重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一，是菌體細(xì)胞組成的原料，也是菌體生長(zhǎng)發(fā)育必需的能源物質(zhì)。碳源單因素試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1　不同碳源對(duì)紅曲菌生產(chǎn)Monacolin K的影響Fig.1　Effect of different carbon source on the production of Monacolin K by Monascus pilosus MS-1

如圖1所示，在5種碳源中，麥芽糖和葡萄糖作為碳源時(shí)Monacolin K的產(chǎn)量較低。甘油作為碳源時(shí)Monacolin K產(chǎn)量較高，這與相關(guān)文獻(xiàn)研究報(bào)道結(jié)果一致［14-15］。以甘油為碳源時(shí)MonacolinK產(chǎn)量為295.8mg/L，高于其它種類(lèi)的碳源，故選甘油為紅曲菌發(fā)酵的碳源。

2.1.2不同接種量對(duì)紅曲菌生產(chǎn)Monacolin K的影響

接種量單因素試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

當(dāng)接種量較少時(shí)，Monacolin K產(chǎn)量較低，可能是因?yàn)榈偷慕臃N量時(shí)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)相對(duì)豐富，利于菌體生長(zhǎng)而使Monacolin K的合成減少。接種量過(guò)大，菌體繁殖過(guò)快，對(duì)Monacolin K的產(chǎn)生有一定阻遏作用。接種量為7%時(shí)，對(duì)應(yīng)Monacolin K產(chǎn)量為231.6 mg/L，高于其它接種量，故選7%為最適接種量。

圖2　不同接種量對(duì)紅曲菌生產(chǎn)Monacolin K的影響Fig.2　Effect of different inoculum size on the the production of Monacolin K by Monascus pilosus MS-1

2.1.3初始pH對(duì)紅曲菌菌生產(chǎn)Monacolin K的影響

發(fā)酵環(huán)境的pH對(duì)微生物的生長(zhǎng)有重要的影響，pH可改變微生物細(xì)胞膜的通透性和細(xì)胞代謝所需的酶的活性，從而影響代謝產(chǎn)物的合成積累。初始pH單因素試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3　初始pH對(duì)紅曲菌生產(chǎn)Monacolin K的影響Fig.3　Effect of the original pH on the the production of Monacolin K by Monascus pilosus MS-1

如圖3所示，當(dāng)初始pH在4.5以下時(shí)，Monacolin K的產(chǎn)量較低。當(dāng)初始pH為5.5時(shí)，對(duì)應(yīng)Monacolin K的產(chǎn)量最高為276.8 mg/L。pH升高或降低時(shí)，Monacolin K的產(chǎn)量都降低。故最適pH為5.5。

2.1.4不同甘油濃度對(duì)紅曲菌生產(chǎn)MonacolinK的影響甘油單因素試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4　甘油濃度對(duì)Monacolin K產(chǎn)生的影響Fig.4　Effect of the concentration of glycerol on Monascus producing Monacolin K

由圖4可以看出，培養(yǎng)基中加入適量甘油可極大的提高M(jìn)onacolin K的產(chǎn)量，但是較高濃度的甘油又使其產(chǎn)量降低，當(dāng)甘油濃度為20 g/L時(shí)，對(duì)應(yīng)Monacolin K的產(chǎn)量較高，為215.04 mg/L，故甘油濃度選擇20 g/L。

2.2正交試驗(yàn)

綜合單因素試驗(yàn)確定的初步結(jié)果，應(yīng)用L9（34）正交表設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，選定接種量、初始pH、甘油濃度3個(gè)因素，每個(gè)因素取3個(gè)水平，分別以1、2、3編碼，以Monacolin K產(chǎn)量確定最優(yōu)方案，進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)，共設(shè)立9個(gè)處理組，每組重復(fù)3次。正交試驗(yàn)方案及結(jié)果分析見(jiàn)表2。

表2　L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果及分析表Table 2　The design of L9（34）orthogonal test

由K值得出最優(yōu)方案為A3B3C1，在此條件下Monacolin K的產(chǎn)量為406.24 mg/L，低于9號(hào)試驗(yàn)結(jié)果，因此采用9號(hào)試驗(yàn)A3B3C2作為較優(yōu)方案，即甘油濃度30 g/L、初始pH 6.0、接種量7%，在此條件下Monacolin K的產(chǎn)量達(dá)到415.15 mg/L。

正交試驗(yàn)方差分析見(jiàn)表3。

由此可以得出，各因素對(duì)紅曲菌生產(chǎn)Monacolin K的影響大小順序是A（甘油濃度）>B（初始pH）>C（接種量），其中甘油濃度對(duì)對(duì)結(jié)果有極顯著影響，這與FENG等的研究結(jié)果一致［13］，初始pH對(duì)結(jié)果有顯著性影響，接種量對(duì)結(jié)果影響不顯著。

3　結(jié)論

Monacolin K是一種可抑制體內(nèi)膽固醇合成的活性物質(zhì)，紅曲菌Monascus pilosus MS-1在一定條件下能合成Monacolin K且不產(chǎn)桔霉素［13］。本試驗(yàn)用Monascus pilosus MS-1發(fā)酵豆?jié){生產(chǎn)Monacolin K。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)對(duì)紅曲菌生產(chǎn)Monacolin K液態(tài)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得到的發(fā)酵條件為甘油濃度30 g/L，初始pH6.0，接種量7%，在此條件下發(fā)酵10 d后Monacolin K的產(chǎn)量達(dá)到415.15 mg/L。本試驗(yàn)制作的紅曲豆?jié){既含有大豆豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，又有Monacolin K的保健功能，在食品及醫(yī)藥領(lǐng)域有一定的應(yīng)用前景。下一步將進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究紅曲豆?jié){的降低膽固醇效果，為紅曲豆?jié){的實(shí)際應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

Monacolin K作為一種次級(jí)代謝產(chǎn)物，其合成受到許多因素的影響。許多不可控因素的變化抑制了Monacolin K的前體物向酸式和內(nèi)酯式Monacolin K的轉(zhuǎn)化［16-17］。FENG等在研究中也發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液中Monacolin K的同系物含量比酸式和內(nèi)酯式Monacolin K的含量高［13］。在本試驗(yàn)中，菌種Monascus pilosus MS-1的發(fā)酵能力比較不穩(wěn)定，不同批次之間Monacolin K的產(chǎn)量有一定差異。分析原因可能有：一是原始菌株經(jīng)過(guò)多次傳代之后菌種不穩(wěn)定；二是MK作為次級(jí)代謝產(chǎn)物，對(duì)環(huán)境條件較敏感，環(huán)境中許多不可控因素的變化可能會(huì)影響Monacolin K的前體物向酸式和內(nèi)酯式Monacolin K的轉(zhuǎn)化。對(duì)于如何控制發(fā)酵參數(shù)，使Monacolin K前體物盡可能轉(zhuǎn)化成酸式和內(nèi)酯式Monacolin K，還需要進(jìn)一步的研究。

［1］王玲，吳軍林，吳清平.紅曲降血脂功能的研究及應(yīng)用概況［J］.食品工業(yè)科技，2014，35（8）：387-389

［2］黃勛，王常蘇，高澤鑫，等.發(fā)芽大豆固態(tài)發(fā)酵功能紅曲產(chǎn)Monacolin K工藝技術(shù)研究［J］.中國(guó)釀造，2014，33（8）：124-127

［3］ENDO A，Monacolin K.A new hypocholesterolemic agent produced by a Monascus species［J］.J Antibiot，1979，32（8）：852-854

［4］孫偉，劉愛(ài)英，梁宗琦.紅曲中莫納可林K（Monacolin K）的研究進(jìn)展［J］.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2003，16（3）：112-116

［5］宋紅平，李梅，馮琳，等.液態(tài)發(fā)酵法產(chǎn)Lovastatin的研究進(jìn)展［J］. 2011，37（8）：136-141

［6］付海平，林親錄，何煜波.紅曲霉中Monacolin K的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)食品添加劑，2003（6）：50-54

［7］丘振宇，王亞琴，許喜林，等.紅曲霉中Monacolin K的應(yīng)用研究［J］.中國(guó)釀造，2007（6）：4-6

［8］趙秀舉，劉志國(guó).紅曲洛伐他汀發(fā)酵條件優(yōu)化及降脂功能［J］.中國(guó)釀造，2014，33（1）：32-35

［9］王艷萍，蔚釧，郗宏波，等.發(fā)酵型酸豆乳工藝條件的研究［J］.中國(guó)乳制品工業(yè)，2013，41（3）：61-63

［10］張海生.大豆的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及功效［J］.大豆科技，2012（1）：51-53

［11］馬立麗，梁惠陶，蔣卓勤.血清總膽固醇水平對(duì)大豆蛋白降血脂作用的影響［J］.中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2014，15（6）：597-600

［12］劉新旗，涂叢慧，張連慧，等.大豆蛋白的營(yíng)養(yǎng)保健功能研究現(xiàn)狀［J］.2012，30（2）：1-6

［13］FENG Yan-li，SHAO Yan-chun，ZHOU You-xiang，et al.Monacolin K production by citrinin-free Monascus pilosus MS-1 and fermentation process monitoring［J］.Engineering in Life Sciences，2014（14）：538-545

［14］高嘉安，郭東.產(chǎn)Monacolin K紅曲霉菌的篩選及發(fā)酵條件的研究［J］.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1997，19（3）：85-90

［15］陳泉，吳遠(yuǎn)征，扈進(jìn)冬，等.高產(chǎn)Monacolin K紅曲霉菌種的篩選及液態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化［J］.中國(guó)釀造，2015，34（6）：43-47

［16］Endo A，Negishi Y，Iwashita T，et al.Biosynthesis of ML-236B（compactin）and Monacolin K［J］.J Antibiot，1985，38：444-448

［17］Endo A.Chemistry，biochemistry，and pharmacology of HMG-CoA reductase inhibitors［J］.Klinische Wochenschrift，1988，66（10）：421-427

Research of Monacolin K Production by Monascus pilosus MS-1 with Soybean Milk as Fermentation Culture Medium

MA Shuai，SHAO Ying，TAN Wen-shi，CHEN Tao*
（College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，Hubei，China）

Monascus pilosus MS-1 was used as original strain to produce Monacolin K by liquid state fermentation with soybean milk as basal culture medium.The single factor experiments and orthogonal experiments were adopted to optimize the fermentation conditions of Monacolin K.Using Monacolin K content as index，the results indicated that the optimized fermentation conditions were the concentration of glycerol at 30 g/L，the initial pH at 6.0 and the inoculum size at 7%，Under these conditions，the yield of Monacolin K was up to 415.15 mg/L after 10 days of fermentation.The analysis of variance showed that the concentration of glycerol had highly significant influence on the yield of Monacolin K，and the initial pH had significant influence，but the amount of inoculation had no significant influence.

Monascus；soybeanmilk；MonacolinK；conditionoptimization

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.21.036

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新基金（2014152）

馬帥（1995—），女（漢），在讀本科生，食品質(zhì)量與安全專(zhuān)業(yè)。

陳濤（1979—），男（漢），講師，博士，研究方向：食品發(fā)酵工程。

2015-12-21