程序化藥物釋放納米涂層的構(gòu)建及其體外實驗研究

[摘要] 目的 構(gòu)建肝素、強的松和紫杉醇程序化藥物釋放納米涂層，并考察該納米涂層的體外釋放情況和對血管內(nèi)皮細胞的影響。 方法 結(jié)合異步降解技術(shù)和靜電紡織技術(shù)制備己內(nèi)酯/碳酸亞乙酯共聚物[Poly（CL-co-EC）]的納米載體；高壓液相色譜法測定載藥體系紫杉醇包封率和體外釋放曲線；MTT實驗和乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒分別測定人血管內(nèi)皮細胞的存活率和LDH釋放率。 結(jié)果 程序化藥物釋放體系中肝素、強的松和紫杉醇的包封率分別為97.3%、81.2%和75.7%，載藥量分別為10.4%、9.3%和14.1%。三種藥物在體外均緩慢釋放，60 d時累計釋放量分別達到96%、55%和8%。程序化藥物釋放納米涂層能顯著降低血管內(nèi)皮細胞的存活率并提高LDH釋放率。 結(jié)論 程序化藥物釋放納米涂層能依次緩慢釋放肝素、強的松和紫杉醇，并抑制血管內(nèi)皮細胞生長，對于降低支架植入術(shù)后血管再狹窄有潛在應用價值。

[關(guān)鍵詞] 納米涂層；紫杉醇；強的松；肝素；血管支架；程序化

[中圖分類號] R96 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2014）36-0005-04

Establishment of nano-coating for controlled drug release and its in vitro experiment

YANG Jin MEI Jinhua LIU Zhenjie

Department of Vascular Surgery， Sir Run Run Shaw Hospital Affiliated to Zhejiang University School of Medicine， Hangzhou 310016，China

[Abstract] Objective To establish a nano-coating for controlled heparin/prednisone/taxol release and investigate the release curve of the nano coating and effects on vascular endothelial cells. Methods The technology of asynchronous degradation and electrostatic spinning technique were used to prepare nano-drug carrier. High pressure liquid chromatography（HPLC） was used to determine the embedding ratio and release curve of nano coating. MTT and lactate dehydrogenase（LDH） kits were applied to test cells survival rate and LDH release respectively. Results The embedding ratios of heparin prednisone and paclitaxel in nano-coating were 97.3%，81.2% and 75.7%， and drug-loading rate were 10.4%，9.3% and 14.1%，respectively. These three drugs were slow-release in vitro and the accumulative release quantities were 96%， 55% and 8%. This nano-coating for controlled drug release significantly reduced the survival rate of vascular endothelial cells and improved the LDH release rate. Conclusion The nano coating for controlled drug release established in this study slowly releases heparin， prednisone and taxol step by step， and inhibits the growth of endothelial cells， which supplies a potential way to reduce vascular restenosis after stent implantation.

[Key words] Nano coating； Taxol； Prednisone； Heparin； Stent； Procedural

動脈粥樣硬化性冠心病的發(fā)生率逐年增加，嚴重威脅著人類健康[1]。藥物洗脫支架作為近年來最為有效的介入治療的一種，是將支架上負載藥物定點釋放到狹窄部位，確保藥物對病灶療效最大化，并將對其他器官的毒副作用降到最小[2]。然而，和其他介入治療一樣，藥物洗脫支架仍存在術(shù)后再狹窄問題[3]，是支架植入術(shù)亟待解決的問題。研究表明[4-6]，支架植入后局部組織出現(xiàn)以下幾個階段性的變化：①2周內(nèi)，血小板聚集，凝血系統(tǒng)激活，同時炎癥細胞聚集，新生內(nèi)皮開始形成；②2～8周內(nèi)，支架表面逐步被新生內(nèi)膜完全覆蓋，平滑肌細胞增殖；③8～32周，細胞外基質(zhì)分泌增多，成纖維細胞增殖，病灶逐漸纖維化。本文擬將分別具有抗增殖、抗炎和抗血栓能力的紫杉醇、強的松和肝素集中于一個高分子藥物釋放系統(tǒng)，并構(gòu)建程序性釋放的納米涂層，旨在分階段有目標性地抑制血管再狹窄的發(fā)生。

靜電紡織是屬于納米技術(shù)中的一種，其可以制作比用常規(guī)方法小幾個數(shù)量級的納米級纖維[7]，易實現(xiàn)藥物在局部的長時間停留和靶向釋放。我們前期研究得出不同單體比例可制備得到不同降解速率的聚己內(nèi)酯和碳酸亞乙酯共聚物[Poly（EC-CL）]材料，且該共聚物表現(xiàn)出了良好的生物相容性和理化性能[8]。本研究即采用[Poly（EC-CL）]共聚物結(jié)合異步降解技術(shù)和靜電紡織技術(shù)，分別將紫杉醇、強的松和肝素涂布于一個納米載體，構(gòu)建出程序性藥物釋放納米涂層，并通過體外試驗初步評價其對血管內(nèi)皮細胞的作用，為今后研制抗內(nèi)膜增殖程序化藥物釋放血管內(nèi)支架的研制提供前期基礎(chǔ)研究。

1 材料與方法

1.1 程序化藥物釋放納米涂層的制備

1.1.1 藥物載體的制備 共聚物Poly（CL-co-EC）的制備參照已發(fā)表文獻[8]，步驟概括如下：①氬氣環(huán)境下，使用Nd（DBMP）3催化合成不同比例CL/EC含量的共聚物Poly（CL-co-EC）。②樣品模壓制備成長×寬×高為30 mm×12 mm×2 mm的規(guī)整板材。③使用靜電紡絲法制備納米級的纖維、膜材料和支架材料。通過調(diào)節(jié)電壓（0～10 kV）、紡絲液流速（0.1 mL/h～5 mL/h），制備不同納米直徑的纖維。

1.1.2 藥物包埋與涂布 紫杉醇的包埋：對CL/EC=9的Poly（CL-co-EC）共聚物混合己二酸酐進行電紡制備孔隙率在90%以上的電紡膜，電紡絲直徑在400～800 nm。先期在生理鹽水中靜置3 d，等酸酐降解后進行掃描電鏡觀察，并用DMSO溶解紫杉醇，包裹于共聚物顆粒中，顆粒直徑在100 nm左右。將先期降解后的Poly（CL-co-EC）電紡膜置于DMSO溶液中24 h，常溫。

強的松和肝素的包埋和涂布：表面靜電紡CL/EC=6的Poly（CL-co-EC）共聚物電紡絲，以控制紫杉醇的釋放。將該薄膜置于一定濃度強的松的溶液中24 h，再進行表面電紡CL/EC=4的Poly（CL-co-EC）共聚物電紡絲，對程序性降解電紡涂層進行表面涂布肝素。

1.2 藥物體外釋放實驗

準確稱取程序化釋放藥物加磷酸鹽緩沖溶液（10 mmol/L、pH 7.4）制成均一懸浮液，置于恒溫水浴搖床（37℃）中，在130 r/min條件下進行釋放實驗。每24 h用等體積新鮮緩沖液更換一次釋放液，更換出的釋放液用HPLC測定紫杉醇、強的松和肝素濃度，HPLC實驗條件：反相C18色譜柱（150.0 mm×4.6 mm，5 m）；流動相為乙腈-水（50∶50，V/V）；流速為1.0 mL/min。紫杉醇、強的松和肝素檢測波長分別為227 nm、240 nm、215 nm。分別以紫杉醇、強的松和肝素為外標對照品，采用外標一點法計算各物質(zhì)含量，繪制累積釋放曲線。

1.3 體外細胞實驗

1.3.1 細胞原代培養(yǎng) 取人體廢棄大隱靜脈10～15 cm，PBS溶液洗去殘血，0.1%的粗制膠原酶消化3～10 min，得到含內(nèi)皮細胞的消化液，PBS溶液沖洗后離心去上清，加入RPMI1640培養(yǎng)液制成細胞懸液，在37℃、5%的二氧化碳孵育箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞進行試驗。

1.3.2 細胞存活率實驗 MTT試劑盒測定細胞存活率。以104/孔密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔200 μL，每組均設(shè)6個復孔。細胞貼壁后換無血清培養(yǎng)基作用24 h，使細胞同步于G0期，分別給予紫杉醇、紫杉醇+強的松和紫杉醇+強的松+肝素的相應血清加以刺激，于共同培養(yǎng)24、72 h終止，刺激結(jié)束后加入5 mg/mL MTT 20 μL/孔，37℃，5% CO2孵育4 h，小心吸取上清，加入DMSO 150 μL/孔，充分混勻，在492 nm 波長下測定OD值，然后計算存活率。

1.3.3 乳酸鹽脫氫酶釋放試驗 乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒檢測細胞LDH釋放量，步驟概括如下：按5000 cell/孔將細胞懸浮液置入96孔板中，先用含5%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基100 μL培養(yǎng)24 h。24 h后96孔板試驗孔換成含5%FBS和不同階段納米涂層（紫杉醇、紫杉醇+強的松和紫杉醇+強的松+肝素）的24 h或72 h RPMI 1640浸提液100 μL進行培養(yǎng)。加試劑盒工作液并避光30 min后于490 nm下測定OD值。乳酸脫氫酶（LDH）釋放率=（處理樣品OD-樣品對照孔OD）/（最大酶活性O(shè)D-樣品對照孔OD）×100%。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用 SPSS 17.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)單因素方差分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間兩兩比較采用LSD法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 程序化藥物釋放納米涂層的表征

程序化藥物釋放體系中紫杉醇、強的松和肝素的包封率分別為（75.7±4.2）%、（81.2±5.3）%和（97.3±4.6）%，載藥量分別為（14.1±1.9）%、（9.3±1.6）%和（10.4±2.1）%，見表1。

表1 程序化藥物釋放體系中藥物的包封率和載藥量（x±s，%）

2.2 程序化藥物體外釋放實驗

從圖1可以看出，肝素、強的松和紫杉醇依次從載體中緩慢釋放，在釋放實驗的第60天時，肝素的累積釋放量達到96%，強的松的累積釋放量達到55%，紫杉醇的累積釋放量僅有8%。

2.3 程序化藥物釋放納米涂層在血管內(nèi)皮細胞的作用

對電紡絲逐步涂布紫杉醇、強的松和肝素，制備得到程序性釋放納米藥物。從表2可知，紫杉醇涂布的納米藥物作用血管內(nèi)皮細胞24 h，細胞存活率顯著下降（P<0.05）；作用72 h后，細胞存活率降到空白組的45.2%（P<0.05），再涂布強的松后，內(nèi)皮細胞存活率同樣顯著下降（P<0.05）；肝素涂布后，對內(nèi)皮細胞也有類似作用。

此外，紫杉醇、紫杉醇+強的松和紫杉醇+強的松+肝素的不同涂布階段納米藥物作用血管內(nèi)皮細胞24 h后，細胞LDH釋放率較空白組和陰性對照組均顯著上升（P<0.05），分別為8.7%（P<0.05）、6.4%（P<0.05）和7.3%（P<0.05）；納米藥物作用72 h后，細胞LDH釋放率分別達到15.6%、13.5%和13.9%，均顯著高于空白組和陰性對照組水平（P<0.05）。

表2 程序化納米藥物對血管內(nèi)皮細胞的影響（x±s，%）

注：陰性對照為空載納米材料處理組；*表示與空白組相比，P<0.05； #表示與陰性對照組相比，P<0.05；LDH：乳酸脫氫酶

3 討論

由于人口老齡化和飲食食譜的改變，動脈粥樣硬化性導致的缺血性疾病發(fā)病率逐年升高。目前針對局部動脈狹窄的主要治療手段是動脈旁路手術(shù)和經(jīng)皮動脈腔內(nèi)介入治療。其中介入治療創(chuàng)傷小、恢復快、患者易于接受，是目前各大醫(yī)療中心常用的治療手段。上世紀70年代出現(xiàn)的經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈成形術(shù)，是利用球囊直接擴張狹窄的動脈，改善血流供應，但術(shù)后管腔彈性回縮，局部平滑肌及細胞外基質(zhì)增生會導致管腔再狹窄[9]，二次手術(shù)率高達30%～50%。80年代出現(xiàn)的血管內(nèi)支架植入術(shù)，解決了管腔彈性回縮造成的術(shù)后管腔丟失，降低了再狹窄率，但仍存在管腔和管壁重構(gòu)導致的支架內(nèi)再狹窄，其6個月內(nèi)再狹窄率約為20%左右[10]。近年來出現(xiàn)的藥物洗脫支架，在支架支撐血管的同時，涂層中的藥物能選擇性地抑制內(nèi)膜和平滑肌細胞過度增殖和遷移，更為有效地避免了血管再狹窄[11]。然而藥物洗脫支架植入后仍有5%～10%的再狹窄率。目前研究認為，支架內(nèi)再狹窄可能與凝血系統(tǒng)激活、局部炎癥反應、血管再內(nèi)皮化受阻、局部細胞外基質(zhì)堆積以及平滑肌細胞的遷移與增殖有關(guān)，且是一個多因素相互影響的復雜過程[12]。另一方面，支架植入后隨著時間的不同，支架局部組織的病理生理進程呈現(xiàn)出階段性的變化。因此單獨一種藥物涂布的支架僅僅在某一階段的某一方面改善血管再狹窄，這可能是現(xiàn)有藥物洗脫支架植入后血管再狹窄的重要原因之一。

醫(yī)用血管支架最常用的兩種材料是可降解合金和可降解高分子材料[13，14]，前者具有良好的支撐性能，而高分子材料更加多樣的結(jié)構(gòu)特性和可控的降解速率得到更多關(guān)注。本研究采用了新型高分子材料聚己內(nèi)酯和碳酸亞乙酯共聚物Poly（CL-co-EC）來構(gòu)建藥物涂層，經(jīng)前期研究發(fā)現(xiàn)該材料在降解的同時能保持其整體性和支撐力，同時表現(xiàn)出了良好的生物相容性和理化性能[8]，而酸酐混紡使得該材料涂層提高了空隙率，增大了載藥量和常溫加藥。不同比例CL和EC的共聚物具有不同的降解時間，本研究逐步將紫杉醇、強的松和肝素分別涂布于CL/EC=9、CL/EC=6和CL/EC=4的Poly（CL-co-EC）納米載體中，構(gòu)建出程序性釋放納米藥物。

HPLC檢測程序性納米藥物體外釋放情況，結(jié)果與預期一致：肝素、強的松和紫杉醇分別先后緩慢釋放，在實驗結(jié)束時（第60天），肝素累計釋放量達到96%，強的松達55%，紫杉醇最后釋放，累計釋放量達8%。肝素是一種抗凝劑[15]，其最先釋放能起到抑制血小板聚集的作用，從而降低或推遲新生內(nèi)皮的形成。強的松可以通過抑制結(jié)締組織增生、降低毛細血管壁和細胞膜的通透性以抑制炎性反應[16]，本研究中強的松從第10天開始緩慢釋放，以期能改善植入支架周圍血管壁的炎性狀態(tài)。肝素和強的松的共同釋放均能抑制新生內(nèi)膜的形成。紫杉醇能使細胞停留在G2/M期進而導致其死亡，是臨床上被廣泛使用的一種抗增殖藥[17]。本研究中紫杉醇從第25天開始有少量釋放，實驗末期時累積釋放量達10%。由于CL/EC=9的Poly（CL-co-EC）共聚物降解周期遠超出60 d，預計紫杉醇在60 d之后的釋放量將持續(xù)增加，這個過程可以抑制血管成纖維細胞的增殖。

本研究中構(gòu)建的這種程序化釋放藥物以期在支架植入后不同階段對抗支架局部組織的病理狀態(tài)，第一階段：肝素和強的松進行先期釋放，起抗凝和抑制局部炎癥的作用；第二階段：強的松和紫杉醇的釋放，抑制平滑肌細胞的遷移、增殖，抑制內(nèi)膜過度增生；第三階段：紫杉醇釋放，抑制成纖維細胞增生和膠原合成。體外實驗證實該研究中構(gòu)建的程序化釋放納米涂層具有抑制血管內(nèi)皮細胞生長的作用。而程序化藥物釋放納米涂層支架在血管內(nèi)的作用還有待進一步的動物實驗來驗證。

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（收稿日期：2014-08-14）