贛南地區(qū)非綜合征性唇腭裂患者血漿代謝組學(xué)研究

[摘要] 目的 通過(guò)檢測(cè)贛南地區(qū)非綜合性唇腭裂（NSCL/P）患者與正常人血漿內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的變化，探討基于核磁共振（NMR）的代謝組學(xué)方法在臨床實(shí)踐中的可行性。 方法 分別收集17例NSCL/P患者和16例正常人對(duì)照組的血漿樣品，測(cè)定NSCL/P患者血漿的一維1H-NMR圖譜，采用主成分分析法（PCA）分析NMR數(shù)據(jù)，以鑒別NSCL/P組和正常對(duì)照組血漿中內(nèi)源血漿代謝產(chǎn)物的變化，獲得NSCL/P患者的特征代謝物。 結(jié)果 NSCL/P組和正常對(duì)照組間的血漿代謝產(chǎn)物存在明顯差別。與正常對(duì)照組相比，NSCL/P患者血漿中的纈氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的含量升高；NSCL/P患者血漿中的丙氨酸、膽堿、磷酰膽堿等代謝物的含量降低。 結(jié)論 采用基于NMR的代謝組學(xué)技術(shù)能較好地反映贛南地區(qū)NSCL/P患者血漿的代謝變化，通過(guò)1H-NMR代謝圖譜獲得NSCL/P的特征代謝物，可以初步探討NSCL/P的代謝機(jī)制，表明了該技術(shù)在臨床應(yīng)用中具有很大的潛能。

[關(guān)鍵詞] 代謝組學(xué)；非綜合征性唇腭裂；主成分分析；血漿

[中圖分類號(hào)] R782.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2014）36-0059-04

Preliminary investigation on plasma of non-syndromic NSCL/P using NMR-based metabonomics in southern Jiangxi

LING Yongchang1 LIU Ruizhen2 LIU Xiang1 ZHANG Ying1 LI Niansheng1

1.Department of Stomatology， the First Affiliated Hospital of Gannan Medical College， Ganzhou 341000， China； 2.Laboratory of Anatomy， Gannan Medical College， Ganzhou 341000， China

[Abstract] Objective To study the metabolic changes in plasma of non-syndromic cleft lip and/or palate （NSCL/P） patients in southern Jiangxi and to explore the feasibility of employing nuclear magnetic resonance （NMR）-based metabonomics in clinical practice. Methods Plasma samples were collected from 17 NSCL/P patients and 16 healthy controls. 1-dimensional 1H-NMR spectroscopy and principal component analysis（PCA） was performed to analyze plasma metabolomic profile. Discriminating metabolites were identified and the metabonomic difference in plasma was examined between NSCL/P patients and the control group. Results The plasma metabolic profiling in NSCL/P patients was clearly distinct from that of healthy controls. Compared with the control group， valine， phenylalanine and tyrosine were higher in plasma of NSCLP patients， while the levels of metabolites in plasma such as alanine， choline and phosphocholine were lower. Conclusion NMR-based metabonomics approach could clearly reflect the metabolic changes of plasma in NSCL/P patients. Our study clearly demonstrated the great potential of the NMR-based metabonomics approach in elucidating the NSCL/P plasma metabolism and the feasibility of application in clinic diagnosis.

[Key words] Metabonomics； NSCL/P； PCA； Plasma

唇腭裂是常見(jiàn)的頜面發(fā)育畸形，其中非綜合征性唇腭裂是常見(jiàn)的先天性畸形，它是指不伴發(fā)其他系統(tǒng)器官畸形，不在綜合癥之內(nèi)唇裂合并腭裂，是一種多基因易感性疾病，有復(fù)雜的遺傳特點(diǎn)[1，2]，在致畸因素的影響下可能于胚胎發(fā)育的4～12周發(fā)生，環(huán)境因素也是此癥發(fā)生的重要原因。包括孕早期吸煙、飲酒、藥物、營(yíng)養(yǎng)缺乏、病毒感染、高熱[3，4]。治療過(guò)程有一點(diǎn)難度，且周期較長(zhǎng)[5]。

代謝組學(xué)作為新近發(fā)展起來(lái)的一門學(xué)科，是指對(duì)由于生理病理刺激而引起的生物體代謝產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)變化同時(shí)進(jìn)行定性和定量分析的一門科學(xué)。主要是通過(guò)檢測(cè)生物體液和組織的NMR圖譜，對(duì)生命系統(tǒng)內(nèi)小分子代謝物進(jìn)行定量分析，通過(guò)模式識(shí)別和多元統(tǒng)計(jì)分析的方法進(jìn)行系統(tǒng)測(cè)量、分析，將代謝物與生理病理刺激下的相關(guān)生物學(xué)事件聯(lián)系起來(lái)，以確定變化發(fā)生的作用靶點(diǎn)，進(jìn)而確定相關(guān)的特征生物標(biāo)志物[6，7]。迄今，代謝組學(xué)研究中常用的分析工具是NMR，尤其是1H-NMR[8，9]。

本研究旨在運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)檢測(cè)唇腭裂患者血漿，研究比較先天性唇腭裂患者和正常人的血漿代謝情況，找出兩者間的差異，初步探討唇腭裂患者血漿代謝的可能機(jī)制，從而為未來(lái)唇腭裂患者的早期診斷提供潛在的檢測(cè)代謝物。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)儀器

本試驗(yàn)使用的主要儀器有：Bruker Avance DRX 600核磁共振儀（Bruker公司，德國(guó)）；XYJ80-2低速離心機(jī)（江蘇金壇實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；MR1812高速離心機(jī)（jouan公司，法國(guó)）；4 mL肝素鈉抗凝管（Becton Dickinson公司，美國(guó)）；F6-1冷凍干燥機(jī)（北京博康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

1.2血漿樣本的采集

隨機(jī)采取2013年7月～2014年7月在我院口腔科診斷為非綜合征性唇腭裂患者的血漿（17例）。診斷為非綜合征性唇腭裂的患者無(wú)單基因引起面裂的家族史，無(wú)相關(guān)致畸因子接觸史，不伴發(fā)其他畸形且身體發(fā)育正常[10]。其中單純性腭裂患者8例，唇裂并發(fā)腭裂患者9例；女12例，男5例；年齡6～18歲，平均（8±4.8）歲。并隨機(jī)選擇2013年在贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院健康體檢科查體的健康人17例作為正常對(duì)照組，女12例，男5例；年齡7～20歲，平均（12.0±5.1）歲。

1.3 研究方法

1.3.1 樣本的采集及處理 血液樣本采集前，要求研究對(duì)象空腹6 h以上。一次性靜脈采血器抽取4 mL血液注入肝素鈉抗凝管中，室溫下1500 r/min離心15 min，然后取上清液2 mL放入去酶的EP管內(nèi)，在渦旋混勻器上快速混勻1 min后于4℃、14000 r/min離心15 min。吸取二次離心后的上清液1.5 mL放入干凈的EP管內(nèi)，并立即放入20℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 NMR數(shù)據(jù)的采集 ①預(yù)處理樣本：冷凍血清室溫下解凍，離心后取上層血清200 μL加至5 mm的核磁管中，加入300 μL的重水（用于鎖場(chǎng)），振蕩混勻。②獲取1H-NMR譜圖：運(yùn)用Varian 600 MHz 譜儀進(jìn)行NMR 實(shí)驗(yàn)，1H-NMR共振頻率為599.93 MHz。橫向弛豫加權(quán)實(shí)驗(yàn)采用水峰抑制的Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）序列，弛豫延遲2.0 s，采集時(shí)間為1.5 s，譜寬12000.0 Hz，溫度25℃，總回波時(shí)間100 ms，累計(jì)次數(shù)64次。對(duì)所有一維1H-NMR譜在Topspin軟件（3.0，Bruker Biospin，德國(guó)）上進(jìn)行相位和基線矯正后，用α-葡萄糖在低場(chǎng)處的雙峰定標(biāo)（5.23 ppm）。用AMIX軟件（V3.9.11，Bruker Biospin，德國(guó)）對(duì)定標(biāo)后的譜圖在0.50～9.50 ppm的區(qū)域分段積分，積分區(qū)間寬為0.002 ppm。為了消除殘余水峰、尿素峰以及外源信號(hào)的影響，去掉6.88～4.21 ppm 一段包含殘余的水峰和尿素峰。之后，對(duì)核磁譜圖進(jìn)行總面積歸一化處理。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P+軟件包（11.0，Umetrics，瑞典）進(jìn)行多變量分析。PCA、PLS-DA和OPLS-DA均取第一和第二兩個(gè)主成分，均用得分圖（Scores plot）表示。PCA結(jié)果主要觀察樣品整體的聚類情況以及是否存在離群點(diǎn)。PLS-DA和OPLS-DA采用UV方式進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，并運(yùn)用交叉驗(yàn)證和排列試驗(yàn)對(duì)模型可靠性進(jìn)行驗(yàn)證。對(duì)通過(guò)驗(yàn)證的模型（P<0.05），用相關(guān)系數(shù)負(fù)載圖（Loading Plot）表示出有貢獻(xiàn)的物質(zhì)及其貢獻(xiàn)的大?。╮值），顏色越暖貢獻(xiàn)越大。通過(guò)皮爾遜相關(guān)系數(shù)的顯著性差異檢測(cè)（Pearson’s product-moment correlation coefficient）判定具有顯著性變化的代謝物，進(jìn)而對(duì)這些物質(zhì)進(jìn)行生物學(xué)解釋。

2 結(jié)果

2.1 NSCL/P患者與正常人血漿1H-NMR代謝圖譜比較

將正常對(duì)照組和NSCL/P組尿液1H-NMR指紋圖譜放大6倍并進(jìn)行疊加比較。波譜顯示了兩組樣品在（δ0.5～5.5 和δ5.5～9.0）的化學(xué)位移處存在差異波峰。關(guān)鍵詞：1，lipid脂質(zhì)；2，valine纈氨酸；3，leucine亮氨酸；4，isoleucine異亮氨酸；5，3-hydroxybutyrate（3-HB）羥基丁酸；6，lactate乳酸；7，alanine丙氨酸；8，lysine賴氨酸；9，acetate醋酸；11，glutamate谷氨酸；12，pyruvate丙酮酸；13，succinate琥珀酸；14，citrate檸檬酸； 15，malate蘋果酸；16，trimethylae（TMA）三甲胺鹽酸鹽；17，dimethylglycine（DMG）二甲基甘氨酸；18，creatine肌酸；19，choline膽堿；20，phosphorylcholine（PC）磷酸膽堿；21，glycerophosphocholine（GPC）甘油磷酰膽堿；22，trimethylamine-N-oxide（TMAO） 氧化三甲胺；23，β-glucose葡萄糖；24，α-glucose右旋糖；25，scyllo-inositol青蟹肌醇；26，glycine甘氨酸；27 urea尿素；28，histidine組氨酸；29，tyrosine酪氨酸30，phenylalanine苯丙氨酸31，formate甲酸鹽，見(jiàn)圖1。

2.2 PCA分析

為了分析各個(gè)樣品之間的關(guān)系，將校正后的數(shù)據(jù)做PCA分析。PCA是可以將分散在一組變量上的代謝圖譜信息集中到某幾個(gè)綜合指標(biāo)上的統(tǒng)計(jì)分析方法，利用主成分分析機(jī)體代謝的變化特征。采用SIMCA-P+軟件（V11.0，Umetrics AB，Umea，Sweden）對(duì)歸一化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行模式識(shí)別多變量分析，PCA采用中心化換算（mean center scaling，Ctr）的數(shù)據(jù)標(biāo)度換算方式。見(jiàn)封三圖1。

2.3 PLS-DA分析

利用SIMCA-P+軟件（V11.0，Umetrics AB，Umea，Sweden）對(duì)歸一化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行偏最小二乘法（PLS）發(fā)現(xiàn)NMR 數(shù)據(jù)（X變量）和其他變量（Y變量，分組信息）之間的相關(guān)聯(lián)系。偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）使用自適換算（unit variance scaling，UV）的數(shù)據(jù)標(biāo)度換算方式。同時(shí)用交叉驗(yàn)證后得到的R2X 和Q2（分別代表模型可解釋的變量和模型的可預(yù)測(cè)度）評(píng)判模型的有效性。然后，通過(guò)排列實(shí)驗(yàn)隨機(jī)多次（n=200）改變分類變量y 的排列順序得到相應(yīng)不同的隨機(jī)Q2值進(jìn)一步檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷挠行?。?jiàn)封三圖2。說(shuō)明以模型的可解釋指標(biāo)R2X 和可預(yù)測(cè)指標(biāo)Q2，結(jié)合排列試驗(yàn)檢驗(yàn)結(jié)果共同顯示，血清樣本的NSCLP組和Control組所建立的模型成立。從得分圖可以看出，兩組數(shù)據(jù)雖然沒(méi)有截然分開(kāi)，但有各自的類聚關(guān)系，可以將兩者區(qū)分開(kāi)來(lái)，說(shuō)明NSCLP組樣本的代謝組出現(xiàn)顯著性差異。

2.4 OPLS-DA分析

正交矯正處理（OPLS-DA）PLS-DA 模型，使用SIMCA-P+軟件（V11.0， Umetrics AB， Umea， Sweden）進(jìn)行正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA），最大化地凸顯模型內(nèi)部不同組別間的差異。OPLS-DA 同時(shí)使用自適換算（unit variance scaling，UV）的數(shù)據(jù)標(biāo)度換算方式。見(jiàn)封三圖3。

2.5組間血漿差異代謝物統(tǒng)計(jì)

通過(guò)對(duì)OPLS-DA 的分析，分析不同組間血漿各代謝物相應(yīng)的相關(guān)系數(shù)，進(jìn)一步歸納有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的代謝物。在相關(guān)系數(shù)圖中，將每一個(gè)變量的loading 值與其標(biāo)準(zhǔn)偏差的平方根值相乘后進(jìn)行數(shù)據(jù)的回溯轉(zhuǎn)換。然后與相應(yīng)的相關(guān)系數(shù)臨界值表進(jìn)行比對(duì)，統(tǒng)計(jì)引起組間差異的代謝物。與正常對(duì)照組相比，NSCL/P患者血漿中的纈氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的含量升高；從表1可知，NSCL/P患者血漿中的丙氨酸、膽堿、磷酰膽堿等代謝物的含量降低。

表1 兩組血漿中代謝物的NMR數(shù)據(jù)的OPLS-DA系數(shù)（相關(guān)系數(shù)│r│> 0.468被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異）

3 討論

先天性唇腭裂嚴(yán)重危害著口腔頜面器官的形態(tài)及功能，不僅影響出生人口素質(zhì)，亦給患者及相關(guān)家庭造成身心負(fù)擔(dān)。該疾病從遺傳學(xué)上可分為綜合征性唇腭裂與非綜合征性唇腭裂兩種，其中更為多見(jiàn)的是非綜合征性唇腭裂。而非綜合征性唇腭裂的發(fā)病原因極其復(fù)雜，有研究表明可能與遺傳和環(huán)境因素[11-13]密切相關(guān)，但截至目前為止，尚未找到明確的直接發(fā)病因素。

一般來(lái)說(shuō)，人體血漿1H-NMR指紋圖譜中的共振吸收峰所對(duì)應(yīng)的化合物與人體血漿中所含生物有機(jī)成分是相同的，但是不同疾病患者血液中生物有機(jī)分子由于病變會(huì)發(fā)生不同程度的改變，從而引起不同疾病的患者和正常人的血漿中所含的生物有機(jī)分子在某種程度上的不同，反映在1H-NMR上也是有所不同的。

本研究運(yùn)用代謝組學(xué)[14]對(duì)比分析了17例非綜合征性唇腭裂患者和17例正常人的血漿樣本，測(cè)定兩者的1H-NMR 圖譜，將正常人對(duì)照組和NSCL/P病患組尿液1H-NMR指紋圖譜放大6倍并進(jìn)行疊加比較。波譜顯示了兩組樣品在（δ0.5～5.5 和δ5.5～9.0）的化學(xué)位移處存在差異波峰。接下來(lái)通過(guò)對(duì)OPLS-DA的分析，分析不同組間血漿各代謝物相應(yīng)的相關(guān)系數(shù)，統(tǒng)計(jì)引起組間差異的代謝物。結(jié)果表明，非綜合征性唇腭裂患者和正常人對(duì)照組間的血漿代謝產(chǎn)物存在明顯差異，這種差異主要是因?yàn)槟承┌被崤c膽堿存在異常代謝。如非綜合征性唇腭裂患者血漿中的纈氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸的含量較正常人有所升高。其中，纈氨酸和苯丙氨酸都為必需氨基酸，纈氨酸通過(guò)作用于乳腺、黃體及卵巢，來(lái)維持神經(jīng)系統(tǒng)功能的正常運(yùn)行。苯丙氨酸的主要作用是確保中樞神經(jīng)系統(tǒng)運(yùn)作正常。同時(shí)與正常健康人相比，非綜合性唇腭裂患者血漿中的丙氨酸、膽堿、磷酰膽堿等代謝物的含量降低。丙氨酸雖為非必須氨基酸，但是起著重要作用?？梢詭椭眢w將葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)槟芰?，同時(shí)還可以協(xié)助肝臟處理和清除體內(nèi)各種不同毒素。這些功能便于給身體提供養(yǎng)料。此外，它還有助于保持血液中葡萄糖的健康水平。膽堿是一種強(qiáng)有機(jī)堿，是卵磷脂的組成成分，也存在于神經(jīng)鞘磷脂之中，是機(jī)體可變甲基的一個(gè)來(lái)源而作用于合成甲基的產(chǎn)物，同時(shí)又是乙酰膽堿的前體。能夠促進(jìn)腦發(fā)育和提高記憶能力，介導(dǎo)信息傳遞，調(diào)控細(xì)胞凋亡。這些代謝物的異常，會(huì)引起一些相關(guān)疾病的發(fā)生。

本研究表明，運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)可以早期篩查某種疾病并探討其代謝機(jī)制，從而有可能推測(cè)其潛在的發(fā)病原因，從而為以后的臨床應(yīng)用提供理論支持。但我們目前的研究?jī)H僅限于技術(shù)層面的一些探索，初步得到一些結(jié)果。在接下來(lái)的研究中，我們準(zhǔn)備拓展實(shí)驗(yàn)：①擴(kuò)大樣本量，使其更具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；②監(jiān)控患者12 h前攝入食物的種類、數(shù)量等，盡量減少實(shí)驗(yàn)誤差[15]。由于目前的研究趨勢(shì)是將代謝組學(xué)與基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)[16]整合起來(lái)，因?yàn)榛蚪M學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)分別在基因、轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物水平上檢測(cè)和鑒別各種分子并研究其生物學(xué)功能[17]。在未來(lái)的研究中，我們將會(huì)從多方面、多角度的深入進(jìn)行非綜合征性唇腭裂患者的血漿研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 代禮，繆蕾，周光萱，等. 1996～2000年中國(guó)圍產(chǎn)兒腭裂畸形發(fā)生狀況分析[J]. 華西口腔醫(yī)學(xué)雜志，2004，11（1）：35-37.

[2] 王麗君，黃金龍，萬(wàn)偉東. 非綜合征性唇腭裂的遺傳因素和環(huán)境因素研究進(jìn)展[J]. 國(guó)外醫(yī)學(xué)·遺傳學(xué)分冊(cè)，2005， 28（2）：102-104.

[3] 陳曼麗，凌彬，林兆全. 非綜合征性唇腭裂基因研究進(jìn)展[J]. 中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志，2009，7（3）：188-191.

[4] 宋叢笑，張嚴(yán). 唇腭裂發(fā)生因素分析[J]. 中國(guó)臨床康復(fù)，2003，7（17）：2495.

[5] 李攻非，柳春明. 唇腭裂患者上頜骨矯形治療[J]. 口腔頜面修復(fù)學(xué)雜志，2001，2（2）：58-60.

[6] Nicholson J K，Lindon J C，Holmes E. Metabonomics：Understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data[J]. Xenobiotica，1999，29（11）：1181-1189.

[7] Lindon J C，Nicholson J K，Holmes E，et al. Contemporary issues in toxicology the role of metabonomics in toxicology and its evaluation by the COMET project[J]. Toxicol Appl Pharmacol，2003，187（3）：137-146.

[8] 楊軍，宋碩林，Jose Castro Perez，等. 代謝組學(xué)及其應(yīng)用[J].生物工程學(xué)報(bào)，2005，25（1）：1-5.

[9] 陳雅竹，劉建國(guó)，白國(guó)輝，等. 代謝組學(xué)在口腔醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 中華臨床醫(yī)師雜志，2013，7（14）：6646-6649.

[10] 石冰. 唇腭裂修復(fù)外科學(xué)[M]. 成都：四川大學(xué)出版社，2004：35.

[11] 唐坤倫，馬瑞，張健. 96例非綜合征性唇腭裂發(fā)病因素的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析[J]. 口腔頜面修復(fù)學(xué)雜志，2013，14（3）：179-182.

[12] 丁艷，劉長(zhǎng)云，王永芹，等. 非綜合征性唇腭裂高危因素的條件Logistic回歸分析[J]. 中華婦幼臨床醫(yī)學(xué)雜志，2008，4（6）：533-536.

[13] 何葦，宋慶高. 造成唇腭裂發(fā)病相關(guān)因素分析[J]. 口腔頜面外科雜志，2007，17（3）：259-261.

[14] 洪毅，談冶雄，王紅陽(yáng). 代謝組學(xué)——腫瘤學(xué)研究的重要技術(shù)平臺(tái)[J]. 中國(guó)腫瘤生物治療雜志，2007，14（6）：585-588.

[15] 宋具昆，周京琳，羅洪，等. 非綜合征性唇腭裂患者血漿代謝組學(xué)的初步研究[J]. 華西口腔醫(yī)學(xué)雜志，2009， 27（2）：147-149.

[16] Kitano H. Systems biology：a brief overview[J]. Science，2002，295（5560）：1662-1664.

[17] German J B，Bauman D E，Burrin D G，et al. Metabolomics in the opening decade of the 21st century：Building the roads to individualized health[J]. J Nutr，2004，134（10）：2729-2732.

（收稿日期：2014-10-31）