結(jié)腸癌組織中IGF—1亞型和Ki—67表達(dá)水平探討

[摘要] 目的 探討結(jié)腸癌組織中IGF-1及其亞型和Ki-67在結(jié)腸癌（CRC）組織中表達(dá)的意義及相關(guān)性。方法 以確診CRC的80例患者為研究對象，術(shù)中收集腫瘤及非腫瘤組織制備標(biāo)本并分別歸入觀察組與對照組。行免疫組化法評估IGF-1及其亞型蛋白和Ki-67抗原的表達(dá)。統(tǒng)計(jì)分析兩者表達(dá)與臨床資料間的關(guān)系。 結(jié)果 ①觀察組IGF-1、IGF-1A、IGF-1B蛋白及Ki-67抗原表達(dá)的標(biāo)志指數(shù)（LI）顯著高于對照組（P<0.05），但I(xiàn)GF-1C蛋白表達(dá)LI無顯著差異；IFG-1與IGF-1A表達(dá)呈正相關(guān)、與Ki-67呈負(fù)相關(guān)，IGF-1B及IGF-1C與Ki-67呈正相關(guān)，上述相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），未見其他顯著相關(guān)性。②IGF-1及其亞型的表達(dá)與患者年齡呈正相關(guān)；IGF-1C及Ki-67的表達(dá)與腫瘤分化程度呈負(fù)相關(guān)；IGF其亞型和Ki-67的表達(dá)與Dukes分期呈正相關(guān)；Ki-67表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。上述相關(guān)性均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），未見其他顯著相關(guān)性。 結(jié)論 IGF-1亞型與Ki-67的表達(dá)存在一定相關(guān)性，而Ki-67表達(dá)上調(diào)與結(jié)腸癌的發(fā)展有關(guān)，因此調(diào)控IGF-1基因表達(dá)可成為結(jié)腸癌治療的新靶點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞] IGF-1；IGF-1亞型；Ki-67；結(jié)腸癌；免疫組織化學(xué)

[中圖分類號] R735.35 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2014）36-0013-03

The discussion of expression level of IGF-1 subtypes and Ki-67 in colorectal cancer tissues

SONG Hui YANG Zhiwei

Department of Emergency， Bao'an People's Hospital of Shenzhen City， Shenzhen 518101， China

[Abstract] Objective To discuss the expression meaning and correlation of IGF-1 subtypes and Ki-67 in colorectal cancer （CRC） tissues. Methods Eighty cases of patients with a definite diagnosis of CRC were selected as the research objects， tumor and non tumor tissue specimens of intraoperative collection were prepared and were divided into observation group and control group. The expression of the subtypes of IGF-1 protein and Ki-67 antigen were assessed by immunohistochemistry method. The relationship between expression and clinical data were statistically analyzed. Results ①IGF-1， IGF-1A， IGF-1B protein and Ki-67 antigen expression index（LI） of observation group were significantly higher than those of control group （P<0.05），but there was no significant difference in IGF-1C protein expression of LI； IFG-1 and IGF-1A expression had positive correlation， negative correlation with Ki-67， IGF-1B IGF-1C and Ki-67 had positive correlation， the correlations above were statistically significant（P<0.05）， there were no other significant correlations. ②The expression of IGF-1 and its subtypes had positive correlation with patient ages； IGF-1C and Ki-67 expression had negative correlation with tumor differentiation degree； Expression of IGF subtypes， Ki-67 and Dukes stages were positively correlated； The expression of Ki-67 was positively correlated with lymph node metastasis. The correlations above were statistically significant （P<0.05）， there were no other significant correlations. Conclusion There are correlations between the IGF-1 subtypes and the expression of Ki-67， The Ki-67 expression up is related to the development of colorectal cancer， therefore regulating and controling IGF-1 gene expression may become a new target treatment for colorectal cancer.

[Key words] IGF-1；IGF-1 subtype； Ki-67；Colorectal cancer； Immunohistochemistry

目前對腫瘤的研究已深入到分子學(xué)水平，取得的主要成果已可以有效地預(yù)測腫瘤的發(fā)展及治療效果，如Ki-67可協(xié)助判斷腫瘤的良惡性及惡性程度，亦是判斷各種臨床因素與患者預(yù)后的有效指標(biāo)[1]，且部分研究已證實(shí)其高表達(dá)與結(jié)腸癌（CRC）腫瘤細(xì)胞的分化程度、Dukes分期有關(guān)[2]，但單獨(dú)控制該因子對疾病的治療并無顯著效果，提示還需尋找到其他相關(guān)因子。近期有研究指出IGF-1及其亞型濃度與CRC風(fēng)險(xiǎn)存在一定相關(guān)性，然不同資料結(jié)果差異較大[3]?；诖?，本研究應(yīng)用免疫組化法全面分析了IGF-1亞型（IGF-1A、IGF-1B、IGF-1C）與Ki-67表達(dá)及臨床資料間的關(guān)系，以期尋找影響結(jié)腸癌發(fā)展的危險(xiǎn)因子，為預(yù)防結(jié)腸癌的發(fā)展提供新的治療靶點(diǎn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機(jī)選取2013年2月～2014年5月間就診于我院普外科并確診CRC的患者，共80例。所有患者均進(jìn)行手術(shù)治療，男女比例53∶27，年齡37～82歲，平均（55.8±6.2）歲；病程1周～19個(gè)月，平均（6.8±1.1）個(gè)月；癌癥原發(fā)病灶位置：升結(jié)腸、橫結(jié)腸、降結(jié)腸、乙狀結(jié)腸比例38∶5∶17∶20；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者31例；癌癥分型：管狀腺癌、黏液腺癌、低分化腺癌、混合型癌比例52∶8∶9∶11。術(shù)中取結(jié)腸癌腫瘤組織標(biāo)本納入觀察組；取腫瘤部位到黏膜下層15 cm組織標(biāo)本納入對照組。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

術(shù)前未予其他輔助性治療；知情同意；病歷資料完整；經(jīng)病理診斷確證。

1.3 檢測方法

1.3.1 主要試劑 兔抗人IGF-1、IGF-1A、IGF-1B、IGF-1C單克隆抗體，鼠抗人Ki-67單克隆抗體，DAB顯色試劑盒、SP試劑盒。上述試劑均購自北京中衫金橋生物有限公司。

1.3.2 免疫組化法 采用SP方法，陽性對照為已知標(biāo)準(zhǔn)陽性切片，陰性對照以PBS代替一抗。其他步驟嚴(yán)格參照試劑盒。流程如下：所有實(shí)驗(yàn)標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛固定、石蠟包埋。行連續(xù)切片，片厚2 μm，以第一張HE染色切片做指示，其余備用。置入65℃環(huán)境下烤片后，行二甲苯脫蠟，并行酒精梯度脫水。處理完畢后，行抗原修復(fù)，滴入pH6.0檸檬酸鹽修復(fù)液，置入微波爐煮沸5 min，室溫冷卻。20 min后以2%雙氧水溶液處理15 min。隨后以pH7.4的0.01 M PBS緩沖液洗5 min，連續(xù)3次。處理完畢后加入一抗，室溫孵育，持續(xù)2 h，隨后再以PBS緩沖液洗5 min，連續(xù)3次。行二抗室溫孵育，持續(xù)30 min，隨后再以PBS緩沖液洗5 min，連續(xù)3次。行DAB顯色，持續(xù)5 min。定量測試切片不復(fù)染，定性觀察切片復(fù)染。統(tǒng)計(jì)陽性表達(dá)情況，行對比分析。

1.3.3 結(jié)果判定 IGF-1及其亞型細(xì)胞陽性：細(xì)胞質(zhì)明顯著色或強(qiáng)色；Ki-67細(xì)胞陽性：腫瘤細(xì)胞核棕褐色染。計(jì)算標(biāo)志指數(shù)（LI）=（陽性細(xì)胞數(shù)/1000個(gè)腫瘤細(xì)胞）×100%，每個(gè)標(biāo)本選擇10個(gè)高倍視野，取平均值。

1.4 觀察指標(biāo)

統(tǒng)計(jì)IGF-1及其亞型蛋白、Ki-67抗體表達(dá)情況，并分析表達(dá)間的相關(guān)性；統(tǒng)計(jì)患者年齡（具體數(shù)據(jù)）、性別（男1，女0）、腫瘤分化情況（高中低分別為3、2、1）、Dukes分期（A、B、C、D分別為1、2、3、4）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況（有1，無0），并分析其與各蛋白表達(dá)的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，行t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析行Spearman相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 觀察組與對照組IGF-1亞型及Ki-67表達(dá)對比

觀察組IGF-1、IGF-1A、IGF-1B蛋白及Ki-67抗原的表達(dá)均顯著性高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；IGF-1C則差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1 觀察組與對照組IGF-1亞型及Ki-67表達(dá)對比（x±s，%）

2.2 IGF-1及其亞型、Ki-67蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

IGF-1及三種亞型均與Ki-67蛋白的表達(dá)存在一定相關(guān)性，其中IGF-1及IGF-1A與其表現(xiàn)出顯著負(fù)相關(guān)性，IGF-1B及IGF-1C與其表現(xiàn)出顯著正相關(guān)性。另IGF-1與IGF-1A間相互正相關(guān)。Spearman相關(guān)性分析提示并無其他顯著相關(guān)性，見表2。

表2 IGF-1及其亞型、Ki-67蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析（r，P）

2.3 IGF-1及其亞型、Ki-67蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)相關(guān)性分析

IGF-1及其亞型、Ki-67蛋白的表達(dá)與CRC臨床病理間存在一定相關(guān)性：IGF-1及其亞型的表達(dá)與患者年齡呈正相關(guān)；IGF-1C及Ki-67的表達(dá)與腫瘤分化程度呈正相關(guān)；IGF其亞型和Ki-67的表達(dá)與Dukes分期呈正相關(guān)；Ki-67的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。Spearman相關(guān)性分析提示并無其他顯著相關(guān)性，見表3。

表3 IGF-1及其亞型、Ki-67蛋白表達(dá)與臨床病理相關(guān)性分析（r，P）

3 討論

為探明腫瘤標(biāo)志物及其對癌癥的影響，科研人員進(jìn)行了不懈的努力。有研究顯示定位于第10號染色體的Ki-67基因可能與多種腫瘤的出現(xiàn)及發(fā)展有關(guān)。該基因調(diào)控生成Ki-67抗原，多大量表達(dá)于增殖期細(xì)胞，有助于評估細(xì)胞增殖，在何曉彬等關(guān)于結(jié)腸癌的研究中，其表達(dá)與癌癥發(fā)生率呈正相關(guān)[4]。有研究指出，其與結(jié)腸癌患者的年齡、性別、Dukes分期及分化程度等重要臨床信息存在顯著相關(guān)性[5]，本研究除在性別方面存在歧義外，亦可支持該論點(diǎn)。性別方面的原因可能與樣本量有關(guān)。雖然此結(jié)論也能有效應(yīng)用于多種癌癥預(yù)后的評價(jià)，但考慮到CRC的致癌因素多、基因檢測困難，且CRC腫瘤形成于遺傳變化有一定關(guān)聯(lián)，我們認(rèn)為還需要從遺傳物質(zhì)的改變及表觀、遺傳改變的累及上探尋更廣泛的腫瘤標(biāo)志物。

既往有研究指出，IGF系統(tǒng)在部分腫瘤中發(fā)揮著重要作用，且IGF-1血清濃度越高、IGF結(jié)合蛋白3血清濃度越低，結(jié)腸癌等的風(fēng)險(xiǎn)越高，許峰等的研究能夠直接證實(shí)血清IGF-1與肺癌的進(jìn)展情況有一定相關(guān)性[6]，考慮到癌癥的通性，此相關(guān)性可能亦可見于CRC患者。但亦有研究指出，血清IGF-1僅與癌癥風(fēng)險(xiǎn)呈相對弱的正相關(guān)性[7]，因此能否應(yīng)用IGF-1評價(jià)CRC風(fēng)險(xiǎn)還具有一定的爭議性。

本研究則直接證實(shí)了IGF-1蛋白的表達(dá)與CRC的發(fā)展沒有顯著關(guān)聯(lián)，但亦可證實(shí)，其亞型因子的表達(dá)可有效預(yù)測CRC的發(fā)展，是值得關(guān)注的研究方向。本研究表明，在癌變組織及癌變周邊組織中，IGF-1、IGF-1A、IGF-1B蛋白及Ki-67抗原的表達(dá)差異顯著，癌變組織中陽性表達(dá)量顯著高于對照組。為進(jìn)一步驗(yàn)證IGF-1及其亞型與Ki-67蛋白表達(dá)的相關(guān)性，本研究對各相關(guān)因子的表達(dá)行Spearman相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，IGF-1及IGF-1A與Ki-67抗原的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，IGF-1B及IGF-1C與Ki-67抗原的表達(dá)呈顯著正相關(guān)，另IGF-1與IGF-1A間呈相互正相關(guān)。這說明各因子的表達(dá)可能存在更深層的相關(guān)機(jī)制，尚需進(jìn)一步研究。

本研究同時(shí)指出，IGF-1的各種亞型均與腫瘤Dukes分期呈正相關(guān)，且IGF-1C與腫瘤的分化程度也存在一定的負(fù)相關(guān)聯(lián)系，且IGF-1及其亞型與Ki-67的表達(dá)也存在一定的相關(guān)性。IGF-1為肽生長因子，生理作用主要為刺激細(xì)胞生長，可表現(xiàn)為激活細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，因此可能與腫瘤細(xì)胞的異常增殖有關(guān)[8]。IGF-1和IGF-1A均與整合素α5β1的超表達(dá)有關(guān)，可抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移[9]，本研究已驗(yàn)證兩者與Ki-67的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；IGF-1B及IGF-1C則能夠刺激細(xì)胞遷移侵襲[10]，本研究亦證實(shí)了兩者與Ki-67呈正相關(guān)。

總之，本研究首先驗(yàn)證了既往認(rèn)為可通過檢測Ki-67評價(jià)腫瘤預(yù)后及發(fā)展的論點(diǎn)，同時(shí)以其為基礎(chǔ)，證明了IGF-1及其亞型在結(jié)腸癌組織表達(dá)中的價(jià)值。我們認(rèn)為調(diào)控IGF-1基因表達(dá)可能成為結(jié)腸癌治療的新靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2014-10-21）