利用組織化學染色和偏振光顯微鏡檢識植物組織中草酸鈣結(jié)晶的研究

摘要 [目的]探討利用組織化學染色和偏振光顯微鏡檢識植物組織中草酸鈣結(jié)晶的可行性。[方法]將閃光相思樹（Acacia stellaticeps Kodela，Tindale D.Keith）葉狀柄用乙二醇甲基丙烯酸酯包埋后制作半薄切片，分別用甲苯胺藍和氨基黑10B對切片進行染色，利用偏振光顯微鏡在透射光和偏振光下對染色的切片進行觀察和拍照，并且與在偏振光下觀察和拍攝到的未染色切片進行對比。[結(jié)果]與單純使用偏振光觀察未染色切片和使用透射光觀察甲苯胺藍或氨基黑10B染色的切片以及使用偏振光觀察氨基黑染色10B的切片相比，用偏振光觀察甲苯胺藍染色的切片能更準確地檢識草酸鈣結(jié)晶。[結(jié)論]該研究為檢識植物組織中草酸鈣結(jié)晶提供一種新的思路和方法。

關鍵詞 組織化學染色；偏振光顯微鏡；植物組織；草酸鈣結(jié)晶

中圖分類號 S184；Q94.336 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）17-05367-02

Abstract [Objective] To explore the feasibility of identifying calcium oxalate crystals in plant tissues by histochemical staining and using polarized light microscope. [Method] Phyllodes of Acacia stellaticeps Kodela， Tindale D. Keith were embedded in glycol methacrylate to obtain semithin sections. The sections were stained by toluidine blue and amido black 10B， respectively. By using polarized light microscope， the stained sections were observed and photographed under both transmitted and polarized light， and compared with unstained sections which were observed and photographed under polarized light. [Result] In comparison with observing unstained sections under polarized light， sections stained by either toluidine blue or amido black 10B under transmitted light， and sections stained by amido black 10B under polarized light， observing toluidine bluestained sections under polarized light could identify calcium oxalate crystals more accurately. [Conclusion] This study provided a new idea and method for identifying calcium oxalate crystals in plant tissues.

Key words Histochemical staining； Polarized light microscope； Plant tissues； Calcium oxalate crystals

偏振光顯微鏡是利用光的偏振特性以及偏振光的干涉和光的雙折射現(xiàn)象制成的。在普通光學顯微鏡的基本構(gòu)造基礎上，增添一套使普通光轉(zhuǎn)變成偏振光（起偏器）和檢測偏振光（檢偏器）的裝置就構(gòu)成偏振光顯微鏡。偏振光發(fā)生干涉時會有顯色。用偏振光顯微鏡觀察不同物質(zhì)時，可以看到不同的彩色。目前，偏振光顯微鏡是對具有雙折射的晶體、液晶態(tài)物質(zhì)進行觀察和研究的重要儀器[1]。

草酸鈣結(jié)晶是植物的次生代謝產(chǎn)物，在植物組織中廣泛存在，其分布具有一定的規(guī)律性，且形態(tài)特征較穩(wěn)定，但不同植物體內(nèi)結(jié)晶的形態(tài)和存在部位具有差異性，因而草酸鈣結(jié)晶特征在植物學中常被作為重要的分類依據(jù)，并成為鑒定植物藥材的重要指標[2-3]。應用常規(guī)方法在普通光學顯微鏡下觀察植物切片時，草酸鈣結(jié)晶常在低倍鏡中被忽視或與其他物質(zhì)混淆，而在高倍鏡中尋找則較困難和費時。研究表明，利用偏振光顯微鏡的正交偏振光可以使植物切片中的草酸鈣結(jié)晶呈現(xiàn)閃光，而其他大多數(shù)組織則看不到或較暗，因此可以較快速地檢識出草酸鈣結(jié)晶[4-5]。但是，由于偏振光通過木質(zhì)部導管、纖維和石細胞時也會產(chǎn)生雙折射現(xiàn)象而使這些組織或細胞呈現(xiàn)閃光[6]，尤其是當草酸鈣結(jié)晶和這些組織或細胞距離較近時，檢識草酸鈣結(jié)晶就變得相對困難。為此，筆者以閃光相思樹（Acacia stellaticeps Kodela，Tindale D.Keith）的葉狀柄為材料，探討利用組織化學染色和偏振光顯微鏡檢識植物組織中草酸鈣結(jié)晶的可行性，以期為檢識草酸鈣結(jié)晶提供更好的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象。在澳大利亞大沙漠采集閃光相思樹的葉狀柄。葉狀柄也稱假葉，是在相思樹的真葉退化后由葉柄擴大形成，主要行使光合和呼吸等生理功能，是閃光相思樹的真正功能葉。

1.1.2 主要試劑。濃度2.5%戊二醛（pH 7.4的0.1 mol/L PBS緩沖液配制），濃度95%乙醇，無水乙醇，乙二醇甲基丙烯酸酯（GMA，pH 6.8～7.2），濃度0.05% 甲苯胺藍（pH 4.4的苯甲酸緩沖液配制），濃度1%氨基黑10B（7% 醋酸溶液配制）。所有試劑均購自澳大利亞西格瑪奧德里奇公司。

1.1.3 主要儀器。真空干燥箱，由澳大利亞電器公司生產(chǎn)；索福半自動半薄切片機，由索福公司生產(chǎn)；配有簡單偏振光裝置的奧林巴斯BX43正置顯微鏡，由奧林巴斯公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 切片制備。取新鮮葉狀柄，用雙面刀片切成3 mm 左右寬的片段，放入濃度2.5%戊二醛溶液中抽真空，用濃度2.5%戊二醛溶液固定24 h；用梯度乙醇（50%-70%-90%-無水乙醇）脫水，每級停留4 h；用無水乙醇和GMA混合液（無水乙醇和GMA體積比為（3 ∶1）-（1 ∶1）-（1 ∶3）浸透，每級浸透24 h；用GMA浸透24 h，更換GMA后再浸透72 h；在55 ℃真空干燥箱中聚合24 h；分割包埋 塊，黏塊，修塊，在半薄切片機上安裝玻璃刀，切成厚度為2 μm 的半薄切片；用鑷子拾取切片，放入載玻片上的水滴中，然后放在60 ℃溫臺上展片、烘干。

1.2.2 染色。將切片分成3組。第1組作為對照不染色；第2組用濃度0.05%甲苯胺藍常溫染色3 min；第3組用濃度1%氨基黑10B常溫染色10 min。將染色的切片用蒸餾水沖洗后放在60 ℃溫臺上烘干。

1.2.3 觀察及拍照。在載玻片上加蓋玻片，使用奧林巴斯BX43顯微鏡對切片進行觀察并拍照。旋入起偏器，調(diào)整光強，將未染色切片在偏振光下觀察和拍照。將用甲苯胺藍和氨基黑10B染色的切片分別在透射光下觀察和拍照，隨后旋入起偏器，將透射光轉(zhuǎn)換為偏振光，調(diào)整光強，對相同區(qū)域在偏振光下進行觀察和拍照。將在透射光下觀察和拍攝到的染色切片的結(jié)果和在偏振光下觀察和拍攝到的染色切片的結(jié)果進行對比，并將在偏振光下觀察和拍攝到的染色切片的結(jié)果和未染色切片的結(jié)果進行對比。

2 結(jié)果與分析

2.1 未染色切片中草酸鈣結(jié)晶的偏振光檢識結(jié)果 由圖1可知，在偏振光照射下，未染色切片中出現(xiàn)2類閃光物質(zhì)，其中閃光度相對較高、呈現(xiàn)黃白色至淺藍綠色的一類為草酸鈣結(jié)晶，閃光度相對較低、呈現(xiàn)灰白色的為加厚的細胞壁。閃光度較低的區(qū)域有時被一條暗區(qū)分隔開來，分隔線大致呈弧形。根據(jù)植物解剖特性判斷，這一暗區(qū)為韌皮部。與草酸鈣結(jié)晶相鄰的低度閃光物質(zhì)為纖維細胞，而與韌皮部相鄰、與草酸鈣結(jié)晶相距較遠的低度閃光物質(zhì)是木質(zhì)部導管。

2.2 染色切片中草酸鈣結(jié)晶的透射光和偏振光檢識結(jié)果由圖2可知，在閃光相思樹葉狀柄中，草酸鈣結(jié)晶主要存在于與纖維細胞相鄰的細胞中。在透射光下檢識甲苯胺藍和氨基黑10B染色切片中的草酸鈣結(jié)晶效果均不理想，但在偏

振光下觀察的效果顯著改善。

甲苯胺藍染色可以使木質(zhì)化的細胞壁呈現(xiàn)綠色或藍綠色，在一定程度上使不被染色的草酸鈣結(jié)晶、纖維細胞以及木質(zhì)部導管得以區(qū)分。當在偏振光下觀察甲苯胺藍染色的切片時，草酸鈣結(jié)晶主要呈現(xiàn)出明亮的黃白色，而被染色的木質(zhì)化細胞壁呈現(xiàn)出藍色閃光，草酸鈣結(jié)晶、纖維細胞以及木質(zhì)部導管之間具有顯著的顏色和亮度差異，比在偏振光下觀察未染色切片更容易準確檢識草酸鈣結(jié)晶。

氨基黑10B主要將核酸和蛋白質(zhì)染成藍色，而草酸鈣結(jié)晶、纖維細胞以及木質(zhì)部導管均不能被染色，在透射光下觀察時，由于缺乏良好的對比度，不易區(qū)分緊密相鄰的草酸鈣結(jié)晶和纖維細胞。氨基黑10B染色的切片與未染色的切片在偏振光下的觀察結(jié)果基本相同，即草酸鈣呈現(xiàn)黃白色至淺藍綠色的較明亮的閃光，而纖維細胞和木質(zhì)部導管細胞壁呈現(xiàn)亮度較低的灰白色，氨基黑10B染色并沒有明顯改善在偏振光下檢識草酸鈣的效果。

3 結(jié)論與討論

目前，使用光學顯微鏡檢識植物組織中草酸鈣結(jié)晶的方法主要有：①使用透射光觀察染色的徒手切片；②使用透射光觀察染色的石蠟或GMA半薄切片；③使用偏振光觀察未染色的徒手切片；④使用偏振光觀察未染色的石蠟或GMA半薄切片。該研究探討了將GMA半薄切片組織化學染色和使用偏振光顯微鏡結(jié)合檢識植物組織中草酸鈣結(jié)晶的可行性，特別是將該方法用于區(qū)分緊密相鄰的草酸鈣結(jié)晶和纖維細胞的可行性。結(jié)果表明，染色劑種類是決定這一方法是否有效的重要因素。

甲苯胺藍是一種多色性堿性染料，可以對多種固定劑和包埋劑處理的動物和植物組織切片進行染色，使得組織和細胞的不同成分被染成不同的顏色[7]。氨基黑10B是一種重要的偶氮類酸性染料，能通過磺酸基與蛋白質(zhì)作用生成一種復合鹽，常被用于動植物組織中的蛋白質(zhì)染色[8-9]。研究中，甲苯胺藍染色和偏振光的結(jié)合使用使得草酸鈣結(jié)晶、纖維細胞以及木質(zhì)部導管之間產(chǎn)生顯著的顏色和亮度差異，但氨基黑10B染色并未產(chǎn)生類似效果。與單純使用偏振光觀察未染色GMA半薄切片和使用透射光觀察甲苯胺藍或氨基黑10B染色的GMA半薄切片以及使用偏振光觀察氨基黑10B染色的GMA半薄切片相比，用偏振光觀察甲苯胺藍染色的切片能更準確地檢識草酸鈣結(jié)晶。由于甲苯胺藍溶液配制簡單，并且在常溫條件下長期保存而不失效，偏振光顯微鏡操作簡單。該研究為檢識植物組織中草酸鈣結(jié)晶提供了一種新的思路和方法。

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