不同凍融條件對(duì)破壁提取巢湖水華新鮮藍(lán)藻中藻藍(lán)蛋白的影響

摘要 [目的]研究不同凍融條件對(duì)破壁提取巢湖水華新鮮藍(lán)藻中藻藍(lán)蛋白的影響，為后續(xù)提取純化試劑級(jí)藻藍(lán)蛋白提供支持。 [方法]在各種條件下，凍融破壁后，利用粗提液中藻藍(lán)蛋白即PC純度和得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究不同凍融次數(shù)、不同含水率和不同凍融介質(zhì)對(duì)藻藍(lán)蛋白提取效果的影響。 [結(jié)果]粗提液中PC純度隨著凍融次數(shù)的增加而依次減小，PC得率隨著凍融次數(shù)的增加呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)；PC純度和得率隨著含水量的增大呈現(xiàn)先持平后降低的趨勢(shì)；在不同凍融介質(zhì)的試驗(yàn)中，通過比較得出最優(yōu)的凍融介質(zhì)為濃度0.002 5 mol/L的PBS緩沖溶液。 [結(jié)論]對(duì)于凍融儲(chǔ)存時(shí)間較長的巢湖新鮮藍(lán)藻，最優(yōu)的試驗(yàn)條件是選用濃度為0.002 5 mol/L的PBS緩沖液作為凍融介質(zhì)，在含水率為96.0%～97.5%區(qū)間凍融次數(shù)僅需1次，即可得到最優(yōu)的PC的純度和得率。

關(guān)鍵詞 新鮮藍(lán)藻；藻藍(lán)蛋白；凍融條件；破壁提取

中圖分類號(hào) S932.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）17-05345-03

Abstract [Objective] To study effects of different freezing and thawing conditions on extraction of the phycocyanin from fresh blue algae， and provide support for extraction of phycocyanin reach the reagent grade level. [Method] Taking repeated freezethaw cycles， the gradient moisture content， the different medium of freezing and thawing experiment were compared based on the phycocyanin purity value and recovery. [Result] Results showed that with the increase of freezing and thawing， the purity values were decreased in turn， and the numerical of recovery were ups and downs. The experiments of the gradient moisture content showed that the purity value and yield value were presented from held the line to decline. The phycocyanin purity and recovery showed that the buffer solution of PBS is better than others， and so is recommended as the optimal medium for the experiments of freeze thawing cycle. [Conclusion] Based on the particularity of preservation conditions for the unnecessarily long of storage， freeze thawing one time can be used as a selection. The result showed that the optional medium is PBS buffer solution， the concentration is 0.002 5 mol/L， and the moisture content of blue alga from 96% to 97.5% is better than others， so it is recommended as a common standard for phycocyanin extraction from blooms water samples in Lake Chaohu.

Key words Fresh blue algae； Phycocyanin； Freezethaw condition；Wall extraction

近年來，隨著水體富營養(yǎng)化程度的加劇，我國淡水湖泊大規(guī)模的水華爆發(fā)日趨頻繁，且暴發(fā)期日愈延長，造成的危害不斷加大。藍(lán)藻是一類極其古老、微小的原核生物，具有極強(qiáng)的生態(tài)競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。伴隨著富營養(yǎng)化，藍(lán)藻會(huì)大量生長與繁殖，形成水華，給水體水質(zhì)帶來嚴(yán)重的危害[1]。水華可導(dǎo)致湖泊魚類等水生生物的死亡、食物鏈的破壞、飲用水源的污染。藍(lán)藻死亡產(chǎn)生的藻毒素可由食物鏈進(jìn)入人體，對(duì)人的身體健康產(chǎn)生很大的威脅，已引起社會(huì)的高度重視。巢湖作為我國五大淡水湖之一，藍(lán)藻水華暴發(fā)頻繁。針對(duì)巢湖水華暴發(fā)后的處理、處置顯得尤為重要。目前，常見的水華藍(lán)藻處理處置辦法有厭氧發(fā)酵、好氧堆肥、藍(lán)藻飼料化、提取藻藍(lán)蛋白（Phycocyanin）。前兩者為低附加值開發(fā)，后兩者為高附加價(jià)值產(chǎn)品開發(fā)和利用。該試驗(yàn)開展主要依托“十二五”水專項(xiàng)，項(xiàng)目要求是研發(fā)出具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的高附加值藻藍(lán)蛋白生產(chǎn)線。實(shí)驗(yàn)室藍(lán)藻破壁處理是提取高純度藻藍(lán)蛋白的基礎(chǔ)。該試驗(yàn)的有序開展將為后期提取純化高純度藻藍(lán)蛋白提供有力支持。

目前，實(shí)驗(yàn)室藍(lán)藻破壁處理的方法較多，常用的有反復(fù)凍融法、化學(xué)試劑處理法、溶脹法、超聲波法等[2-3]。不同研究側(cè)重點(diǎn)不同，基于藻種不同，得到的結(jié)論存在差異。對(duì)于藻藍(lán)蛋白提取效果的評(píng)價(jià)，主要基于粗提液中藻藍(lán)蛋白濃度結(jié)果進(jìn)行，較少做PC純度和得率方面的分析，而PC的純度是藍(lán)藻高附加值研究中最關(guān)鍵的指標(biāo)。另外，通過研究比較，發(fā)現(xiàn)反復(fù)凍融法在破壁提取藻藍(lán)蛋白方面高于其他方法，可推薦作為太湖藍(lán)藻水樣中藻藍(lán)蛋白的提取方法[4]。因太湖和巢湖藍(lán)藻屬性接近，可參考選用反復(fù)凍融法作為破壁粗提取巢湖新鮮藍(lán)藻中藻藍(lán)蛋白的方法。筆者以2013年8月9日采集的巢湖水華藍(lán)藻樣品作為研究對(duì)象，針對(duì)該批次長期冷凍的新鮮藍(lán)藻，以凍融破壁粗提液中PC的純度和得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究不同凍融次數(shù)、不同含水率和不同凍融介質(zhì)對(duì)藻藍(lán)蛋白提取效果的影響。

1 材料與方法

1.1 樣品準(zhǔn)備 新鮮藍(lán)藻采自巢湖西湖區(qū)表層20 cm水體，含水量約為96.2%，采集日期為2013年8月9日。在采樣期間，天氣晴朗，室外氣溫37～38 ℃。藍(lán)藻采集后運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，放入冰柜內(nèi)儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?10 ℃）。將冰柜中凍實(shí)的藍(lán)藻解凍混勻，放入若干支離心管內(nèi)配平，放在冷藏室內(nèi)備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 藻藍(lán)蛋白粗提液的制備。取冷凍保存的巢湖水華藍(lán)藻，在室溫條件下融化。取融化藍(lán)藻于離心管內(nèi)配平、離心，多層紗布過濾，擠凈紫紅色汁液，即為藻藍(lán)蛋白粗提液。進(jìn)行全波段掃描，繪制光譜圖。剩余的已融化藍(lán)藻放于冷柜中冷藏（2～10 ℃）備用，用以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 光譜圖的繪制。藍(lán)藻蛋白粗提液全波長掃描。據(jù)參考文獻(xiàn)藻藍(lán)蛋白在620 nm處有特征吸收峰，蛋白在280 nm處有最大吸收峰，計(jì)算方法為PC純度=A620/A280。以去離子水為空白對(duì)照，以紫外分光光度計(jì)在250～700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，確定粗提液的最大吸收峰和空白吸收值。

1.2.3 含水率計(jì)算方法。取冷凍保存的藍(lán)藻，在室溫下解凍8 h，將其混勻。準(zhǔn)確量取100 ml破壁藍(lán)藻液，放置于燒杯 內(nèi)，并稱質(zhì)量。稱量后，放入烘箱內(nèi)烘烤（90 ℃）30 h，待其烘干后稱量其質(zhì)量。該處置方法重復(fù)3次。根據(jù)公式 W=（M-m）/M*100%，計(jì)算該批新鮮藍(lán)藻的含水率，式中W為含水率；M、m分別為烘干前后100 ml藍(lán)藻的質(zhì)量。

1.2.5 凍融次數(shù)試驗(yàn)。準(zhǔn)確稱取一定量的已解凍冷藏備用的同一罐藍(lán)藻，在-10～20 ℃之間反復(fù)凍融若干次。每次凍融完成后，在8 000 r/min、低溫4 ℃離心10 min。多層紗布過濾，擠干紫紅色汁液。取清液，稀釋至合適倍數(shù)，分別在280、620、650 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算PC純度和得率。

1.2.6 含水率試驗(yàn)。準(zhǔn)確稱取一定量的已解凍冷藏備用的同一罐藍(lán)藻，根據(jù)其含水率分別加入適量的去離子水。配制含水率分別為96.5%、97.0%、97.5%、98.0%、98.5%、99.0%、99.5%及原藻液8組。在-10～20 ℃之間進(jìn)行一次凍融試驗(yàn)。凍融完成后進(jìn)行8 000 r/min、4 ℃離心10 min。多層紗布過濾，擠干紫紅色汁液。每個(gè)處理重復(fù)3次。取清液稀釋至合適倍數(shù)，在280、620、650 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算PC純度和得率。

1.2.7 凍融介質(zhì)試驗(yàn)。根據(jù)已知的最優(yōu)凍融次數(shù)和最優(yōu)含水率，準(zhǔn)確稱取一定量已解凍冷藏備用的同一罐藍(lán)藻，加入

適量的凍融介質(zhì)。試驗(yàn)共設(shè)置4個(gè)水平，分別為0.002 5

mol/L pH 7.0的磷酸緩沖液（PBS）、去離子水、0.1 mol/L的TrisHCl緩沖液、0.1 mol/L的KH2PO4NaOH緩沖液。在-10～20 ℃之間進(jìn)行一次凍融試驗(yàn)。凍融完成后經(jīng)過8 000 r/min、4 ℃離心10 min。多層紗布過濾，擠干紫紅色汁液。每個(gè)處理重復(fù)3次。取清液，稀釋至合適倍數(shù)，進(jìn)行吸光度的測(cè)定，并且進(jìn)行PC純度和得率的計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 光譜圖的繪制 將凍融所得藻藍(lán)蛋白粗提液于250～700 nm處進(jìn)行全波段掃描，可得到粗提液的紫外-可見吸收光譜圖。由圖1可知，藻藍(lán)蛋白在280 nm處有最大的吸收峰，在620 nm處有特征吸收峰。其中，直接凍融破壁后巢湖水華藍(lán)藻溶液中藻藍(lán)蛋白純度為0.511。

2.2 凍融試驗(yàn)次數(shù)對(duì)藍(lán)藻藻藍(lán)蛋白純度和得率的影響 隨著凍融次數(shù)的逐漸增加，PC的純度不斷降低，PC的得率出現(xiàn)反復(fù)，但是整體呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。當(dāng)凍融次數(shù)增加至第6次時(shí)，藻藍(lán)蛋白的純度已由第1次凍融時(shí)的0.511降低至0.304，得率由2.54%下降到2.06%。經(jīng)對(duì)比分析，結(jié)果與文獻(xiàn)[7]所描述的隨著凍融次數(shù)的增加，PC的純度和得率在完成第2次凍融后可取得最優(yōu)值不符。該試驗(yàn)所用藍(lán)藻為巢湖新鮮藍(lán)藻，且新鮮藍(lán)藻經(jīng)長時(shí)間的冷凍、速凍，在含水率較高的情況下基本上完全形成冰晶，將新鮮藍(lán)藻細(xì)胞基本漲破。由圖2可知，經(jīng)多次凍融，雖在一定程度上藍(lán)藻細(xì)胞破碎率有小幅度的上升，但是藻藍(lán)蛋白經(jīng)解凍后有一定的程度上變性，反而隨著次數(shù)的增加，純度、得率均有所下降。因此，對(duì)于新鮮藍(lán)藻，不需要進(jìn)行多次凍融，僅需要1次凍融就能起到較好的效果，并且能起到節(jié)約電能等成本。

2.3 藍(lán)藻含水率對(duì)藍(lán)藻CPC純度和得率的影響 巢湖水華藍(lán)藻所采集的新鮮藍(lán)藻的含水率為96.2%，配制不同含水率的藍(lán)藻藻液。由圖3可知，在凍融次數(shù)選擇1次，凍融介質(zhì)選擇去離子水的情況下，破壁粗提液中PC的純度和得率隨著試驗(yàn)含水率的增加而緩慢降低，PC純度在含水率96%～97.5%之間基本保持一致。研究表明，從含水率為96%時(shí)的0.379下降為含水率為99.5%時(shí)的0.302。PC的得率由1.44%下降至0.21%。經(jīng)分析，隨著含水率的增加，冷凍時(shí)間的增加，解凍時(shí)間也相應(yīng)增加，不僅增加能量消耗，而且導(dǎo)致一定程度上藻藍(lán)蛋白的變性。因此，選擇一定含水率范圍的新鮮藍(lán)藻進(jìn)行凍融較優(yōu)。

2.4 不同凍融介質(zhì)對(duì)藻藍(lán)蛋白純度和得率的影響 選取含水率96.2%的該批次藍(lán)藻，取凍融次數(shù)為1次，分別配制PBS、去離子水、TrisHCl緩沖液和KH2PO4NaOH緩沖液這4種溶液作為凍融介質(zhì)，具體配制方法參考常見緩沖溶液的配制表[8]。由圖4可知，以PBS緩沖液為凍融介質(zhì)的效果最好，藻藍(lán)蛋白粗提液中PC純度為0.37，去離子水次之，最后為TrisHCl緩沖液和KH2PO4NaOH緩沖液。PC得率經(jīng)計(jì)算也表明，以PBS緩沖液為凍融介質(zhì)時(shí)有最大得率。經(jīng)分析，一定濃度的PBS緩沖液最接近生物體的環(huán)境溶液。藻藍(lán)蛋白在該環(huán)境中易于保存，而其他凍融介質(zhì)不具備該特性。因此，后續(xù)試驗(yàn)的開展也將以PBS緩沖液作為凍融介質(zhì)。

3 結(jié)論與討論

（1）在巢湖水華日益加劇的情況下，在控制外源污染的情況下，尋找出高附加值的內(nèi)源處理方法將是一個(gè)很好的研究方向，其中藻藍(lán)蛋白高附加值資源化的研究將顯得尤為重要。它本身就符合循環(huán)經(jīng)濟(jì)的理念。該試驗(yàn)選取巢湖水華時(shí)新鮮藍(lán)藻作為試驗(yàn)對(duì)象，利用藻藍(lán)蛋白粗提液純度和得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究不同凍融次數(shù)、不同含水率和不同凍融介質(zhì)對(duì)藻藍(lán)蛋白提取效果的影響。它對(duì)今后試驗(yàn)的開展有很好的指導(dǎo)意義。

（2）在不同凍融次數(shù)的試驗(yàn)中，藻藍(lán)蛋白粗提液純度和得率呈現(xiàn)不斷下降的趨勢(shì)。分析原因，可能與所采集藍(lán)藻有關(guān)。該批次藍(lán)藻已在-10 ℃條件下儲(chǔ)存5個(gè)月，已經(jīng)完全形成冰晶，解凍后藍(lán)藻細(xì)胞壁完全漲破，在1次解凍后藻藍(lán)蛋白完全釋放出來。隨著凍融次數(shù)的增加，再凍、再解凍的時(shí)間不斷延長，部分解凍后的藻藍(lán)蛋白變性，反而純度和得率出現(xiàn)下降。

（3）該批次藍(lán)藻含水率為96.2%，因此其含水率的配制受到一定的限制，但通過配制不斷遞增的含水率藍(lán)藻，并且進(jìn)行試驗(yàn)。研究表明，當(dāng)含水率為96%～97.5%時(shí)，藻藍(lán)蛋白的粗提液中PC純度基本維持不變。另外，從節(jié)能角度出發(fā)，選取較低一些含水率較好，因此后續(xù)試驗(yàn)將按照原藍(lán)藻液含水率96.2%開展研究。

（4）在不同凍融介質(zhì)的試驗(yàn)中，在凍融次數(shù)為1次的情況下，分別加入4種凍融介質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn)。研究表明，選用PBS緩沖液作為凍融介質(zhì)的試驗(yàn)組，PC的純度和得率最大。分析原因是PBS緩沖液最接近生物環(huán)境條件，PC在PBS緩沖液中最適宜保存。因此，后續(xù)試驗(yàn)將選取PBS緩沖液作為凍融介質(zhì)。

（5）對(duì)于凍融儲(chǔ)存時(shí)間較長的巢湖新鮮藍(lán)藻，在進(jìn)行提取藻藍(lán)蛋白的凍融破壁試驗(yàn)時(shí)，最優(yōu)的試驗(yàn)條件是選用PBS緩沖液作為凍融介質(zhì)，在含水率為96.0%～97.5%區(qū)間時(shí)，凍融次數(shù)僅需1次，即可得到最優(yōu)的PC的純度和得率，為后續(xù)純化藻藍(lán)蛋白提供先決條件。

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