川芎中阿魏酸類效應(yīng)組分的提取純化工藝研究

摘要 [目的]優(yōu)化川芎中阿魏酸類效應(yīng)組分的提取純化工藝條件。[方法]以溶劑量、提取次數(shù)、乙醇濃度、提取時(shí)間為考察因素，以阿魏酸類組分為檢測指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化川芎中阿魏酸類效應(yīng)組分的提取工藝；以樹脂類型、上樣量、除雜溶劑、洗脫溶劑等為考察因素，以阿魏酸為測定指標(biāo)，優(yōu)化阿魏酸類組分的純化工藝。[結(jié)果]確定川芎中阿魏酸類組分優(yōu)化的提取工藝為：料液比1 ∶8（g/ml），乙醇濃度70%，提取3次，每次0.5 h；阿魏酸類組分的純化樹脂為HP300大孔吸附樹脂，上樣量為5 ∶1（川芎：樹脂），2 BV水除雜，2 BV濃度50%乙醇洗脫，回收溶劑、真空干燥，純化物中阿魏酸和總酚酸的含量分別為9.71%和18.69%。[結(jié)論]所優(yōu)化的提取純化條件為川芎效應(yīng)組分的進(jìn)一步研究開發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 川芎（RHIZOMA CHUANXIONG）；阿魏酸；正交試驗(yàn)；大孔吸附樹脂

中圖分類號(hào) S567 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）17-05410-03

Abstract [Objective] To optimize the extraction and purification of ferulic acid ingredients from Chuanxiong Rhizoma. [Method] The effects of solidliquid ratio， extract times， ethanol concentration and extract time were investigated to obtain the extraction technology of the ferulic acid ingredients from Chuanxiong Rhizoma according to the orthogonal test. The purification of the resins for ethanol extracts investigated the resin type， sample amount， cleaning solvent and elution solvent. [Result] The optimal technical conditions were extracted twice with 70% ethanol on the ratio of 1 g ∶ 8 ml for ferulic acid ingredients when treatment time was 30 minutes. The organic acid of Chuanxiong Rhizoma with HPD300 macroporous resin was absorbed effectively.

The proportion of the crude drug and drying macroporous resin was 5 ∶1. The extract was added to the column of macroporous resin， then washed with distilled water and 50% alcohol， respectively. The 50% alcohol eluent was collected， in which the content of ferulic acid and total phenolic acid was 9.71% and 18.69 % in solids， respectively. [Conclusion] The study explores a practical extraction method for ferulic acid ingredients from Chuanxiong Rhizoma and lays a good foundation for its further research.

Key words Chuanxiong Rhizoma； Ferulic acid； Orthogonal test； Macroporous resin

中藥川芎（RHIZOMA CHUANXIONG）為傘形科藁本屬植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）的干燥根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有活血行氣祛風(fēng)止痛的功效，主要用于血瘀氣滯所致的月經(jīng)不調(diào)，痛經(jīng)閉經(jīng)，肝郁氣滯而致血行不暢的胸肋疼痛，頭痛，風(fēng)寒濕痹，跌打腫痛等疾病[1]。川芎中主要活性成分為揮發(fā)油、酚酸類的阿魏酸、苯酞類成分[2-5]。藥理學(xué)研究表明，阿魏酸具有抑制血小板聚集、抑制5-羥色胺從血小板中釋放、阻止靜脈旁路血栓形成、抗動(dòng)脈粥樣硬化、清除自由基、增強(qiáng)免疫功能等多方面的藥理活性[6-9]。因此，川芎總酚酸類尤其是阿魏酸成分是其重要活性成分，篩選川芎中的總酚酸、阿魏酸的提取純化工藝具有一定的藥用價(jià)值和實(shí)際意義。筆者采用多種大孔吸附樹脂篩選出川芎中阿魏酸及總酚酸的提取純化工藝條件，以期為川芎的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象。川芎飲片，購自中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院藥房，標(biāo)示為北京豐泰金源藥業(yè)有限公司（批號(hào)12091002，產(chǎn)地四川），經(jīng)張翠英副研究員鑒定為傘形科植物川芎的干燥根莖加工成的飲片。

1.1.2 主要儀器。Agilent 1200型高效液相色譜儀，配置四元梯度泵、在線脫氣機(jī)、DAD檢測器，購自安捷倫公司；METTLER AB135-S電子天平，購自瑞士；HZS4水浴振蕩器，購自哈爾濱市東聯(lián)電子科技開發(fā)有限公司；B600B型臺(tái)式低速離心機(jī)，購自北京白洋醫(yī)用離心機(jī)有限責(zé)任公司；超純水系統(tǒng)，購自USA Millipore公司。

1.1.3 主要試劑。阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)1107739910），購自中國藥品生物制品檢定所；乙腈（色譜純），購自美國FISHER公司；甲醇和冰醋酸（分析純），購自北京化工廠；乙醇（醫(yī)用乙醇），購自北京鴻志偉達(dá)工貿(mào)有限公司；大孔吸附樹脂HPD100、HPD300、HPD400、HPD400A、HPD450、HPD500、HPD600、HPD700、D101、AB-8和DM130，均購自河北滄州寶恩吸附材料科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 阿魏酸對(duì)照品貯備溶液的制備。精密稱取阿魏酸對(duì)照品適量分別置10 ml棕色量瓶中，加無水乙醇配制成阿魏酸對(duì)照品貯備溶液（0.218 mg/ml）。

1.2.2 含量測定。精密吸取提取液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，正交試驗(yàn)中阿魏酸類組分的檢測采用紫外分光光度法測定，樹脂純化中阿魏酸的檢測采用HPLC法測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)的含量。

1.2.3 川芎的提取溶媒單因素考察。稱取川芎粉末5.00 g，置于圓底燒瓶中，分別加入不同濃度的乙醇溶液（水、濃度20%乙醇、濃度40%乙醇、濃度60%乙醇、濃度80%乙醇和濃度95%乙醇）50 ml，稱重，加熱回流提取30 min，放置室溫，用相應(yīng)的溶劑補(bǔ)足減失的重量，過濾后按上述紫外分光光度法測定阿魏酸類組分的含量。結(jié)果表明，40%～95%乙醇提取率較高，故選擇40%以上的乙醇作為提取溶劑。

1.2.4 川芎的L9（34）正交試驗(yàn)。以對(duì)影響提取效果的主要因素加水量、提取次數(shù)、提取溫度、提取時(shí)間進(jìn)行優(yōu)選，考察指標(biāo)為阿魏酸類效應(yīng)組分的提取率，應(yīng)用L9（34）正交表安排試驗(yàn)，因素及水平安排見表1。稱取川芎粉末9份，每份5.00 g，提取、過濾，濾液合并，適當(dāng)稀釋，采用紫外分光光度法測定阿魏酸類效應(yīng)組分的含量。

1.2.5 大孔吸附樹脂的預(yù)處理。用2 BV（大孔吸附樹脂柱柱床體積）乙醇浸泡24 h以上，用乙醇沖洗，沖洗至無白色混濁物，流出液與水以1 ∶1的比例混合后仍澄清，再用水洗至無醇味。

1.2.6 靜態(tài)吸附篩選樹脂。稱取各型號(hào)大孔吸附樹脂5.00 g，置于錐形瓶中，分別加入已知阿魏酸含量的川芎提濃縮液100 ml，水浴恒溫（30 ℃）振搖（60 r/min）24 h；吸附后的溶液過濾，HPLC法測定阿魏酸，計(jì)算每種樹脂的吸附量。同時(shí)將每種吸附川芎提取液的大孔吸附樹脂分別用4 BV的水、6 BV的濃度50%乙醇、4 BV的濃度70%乙醇依次洗脫，采用HPLC法測定洗脫液中阿魏酸的含量，計(jì)算每種樹脂的比吸附量、比洗脫量。

1.2.7 大孔吸附樹脂的動(dòng)態(tài)吸附。分別稱取預(yù)處理好的HPD300和HPD600大孔吸附樹脂適量，裝入玻璃層析柱（內(nèi)徑1.5 cm），精密吸取川芎水提濃縮液上樣，以4 BV/h上樣，每10 ml流出液取樣一次，HPLC法測定阿魏酸的含量，根據(jù)流出液體積和阿魏酸的滲出量繪制吸附曲線。

1.2.8 除雜溶劑的篩選。取HPD300大孔吸附樹脂5.00 g，加川芎提取液90 ml，上柱流速為4 BV/h，分別用水與5%乙醇除雜，每1 BV流出液取樣一次，HPLC法測定阿魏酸的含量。

1.2.9 洗脫溶劑的篩選和洗脫體積的確定。HPD300大孔吸附樹脂各5.000 g裝入3根層析柱，精密吸取川芎水提濃縮液上樣，先用2 BV水除雜，再分別用濃度15%乙醇、濃度30%乙醇、濃度50%乙醇洗脫，每1 BV洗脫液收集一次，HPLC法測定洗脫液中阿魏酸的含量，根據(jù)流出液體積和阿魏酸的洗脫量繪制洗脫曲線。

1.2.10 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)。取川芎粉碎藥材，濃度70%乙醇，料液比1 ∶8（g/ml），提取3次，每次提取時(shí)間為0.5 h，提取液合并，濃縮至3.6 ml/g；水提濃縮液用HPD300大孔樹脂純化，上樣后用2 BV水除雜，再用2 BV的濃度50%乙醇洗脫，洗脫液濃縮干燥得川芎純化物。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外分光光度法測定阿魏酸類效應(yīng)組分 精密吸取阿魏酸貯備溶液適量分別配制成一系列濃度的對(duì)照品溶液，在最大吸收波長311 nm下測定吸光度，以吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，濃度（X，μg/ml）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，阿魏酸在2.18～21.80 μg/ml濃度范圍內(nèi)與吸光度的線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)方程為Y=91.98 8X-0.007 1（R=0.999 9）。

2.2 HPLC法測定阿魏酸 精密稱取阿魏酸對(duì)照品適量置10 ml棕色量瓶中，加濃度75%甲醇配制成阿魏酸對(duì)照品貯備溶液（0.218 mg/ml）；精密吸取貯備溶液適量分別配制成一系列濃度的對(duì)照品溶液（2.18、4.36、8.72、13.08、17.44、21.8、218 μg/ml）；Agilent TCC18 BDS（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相為無水甲醇-濃度0.5%醋酸（35 ∶65，V/V）；流速為1.0 ml/min；檢測波長321 nm；柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量5 μl，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明：阿魏酸在2.18～218.00 μg/ml濃度范圍內(nèi)與吸光度的線性關(guān)系良好，其回歸方程為Y=21 182.9X-39.301 8（R=0.999 9）。其中對(duì)照品和樣品的HPLC色譜圖見圖1。

2.3 正交試驗(yàn)的結(jié)果分析 根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果（表2）和方差分析結(jié)果可知，因素C（乙醇濃度）和D（提取次數(shù)）對(duì)提取效果影響顯著（P<0.05），因素A（溶劑用量）也有影響，而因素B（提取時(shí)間）的影響非常小，可忽略不計(jì)，故作為誤差項(xiàng)?？紤]最少的溶劑用量和最短的提取時(shí)間，減少濃縮的麻煩，最終確定其最佳提取條件為A2B1C2D3，即料液比1 ∶8（g/ml），乙醇濃度70%，提取3次，每次0.5 h。經(jīng)過3批驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明該工藝穩(wěn)定可行。

2.4 靜態(tài)吸附篩選的結(jié)果 根據(jù)每種樹脂的吸附量、比吸附量、比洗脫量（表3），其中HPD300、HPD500、HPD600、HPD100、AB-8型號(hào)大孔吸附樹脂的比吸附量比較高，同時(shí)結(jié)合樹脂的解吸附情況，HPD300和HPD600樹脂的比解吸附量明顯好于其他樹脂，所以初步選擇此2種樹脂進(jìn)行動(dòng)態(tài)情況考察篩選樹脂。

2.5 大孔吸附樹脂的動(dòng)態(tài)吸附和洗脫情況優(yōu)選樹脂 根據(jù)流出液體積和阿魏酸的滲出量繪制的吸附曲線（圖2）可以看出，HPD300大孔吸附樹脂的上樣量大于90 ml時(shí)，開始有少量阿魏酸滲漏；而HPD600大孔吸附樹脂的上樣量在40 ml時(shí)，開始有阿魏酸滲漏，故HPD300大孔吸附樹脂的動(dòng)態(tài)吸附性能好于HPD600，因此選擇HPD300大孔吸附樹脂作為川芎的吸附純化樹脂，且上樣量為90 ml。

2.6 除雜溶劑的篩選 用2 BV水除雜，HPLC圖譜顯示雜質(zhì)已基本除盡，阿魏酸的洗脫量為0.29 mg；而2 BV濃度5%乙醇除雜，阿魏酸的洗脫量為0.42 mg，乙醇濃度增加阿魏酸的滲漏增加，故選用2 BV水除雜。

2.7 洗脫溶劑的篩選和洗脫體積的確定 根據(jù)流出液體積和阿魏酸的洗脫量繪制洗脫曲線（圖3）可知，濃度50%乙醇的洗脫效果優(yōu)于濃度30%乙醇和濃度15%乙醇，且2 BV的濃度50%乙醇能基本完全洗脫阿魏酸，故選用濃度50%乙醇2 BV進(jìn)行洗脫即可。

2.8 提取純化工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 計(jì)算得川芎純化物的出膏率為0.5%，純化物中阿魏酸和總酚酸的含量分別為9.71%和18.69%，表明通過樹脂純化的方法可以獲得純度較高的川芎阿魏酸類效應(yīng)組分。

3 結(jié)論與討論

樹脂純化分離是一種動(dòng)態(tài)過程，動(dòng)態(tài)過程是以孔徑影響為主，所以動(dòng)態(tài)結(jié)論更加可靠。靜態(tài)吸附是以比表面積為主要影響因素，但靜態(tài)吸附對(duì)于大范圍縮小樹脂范圍有較大的優(yōu)勢(shì)。在篩選樹脂的實(shí)際過程中，需要?jiǎng)討B(tài)吸附和靜態(tài)吸附相結(jié)合，首先采用靜態(tài)吸附更快捷地大范圍初篩樹脂類型，然后以動(dòng)態(tài)吸附法優(yōu)化吸附量、洗脫溶劑、洗脫流速、pH值等各方面的參數(shù)，進(jìn)而確定最合適的大孔吸附樹脂。

洗脫試驗(yàn)結(jié)果表明，盡管乙醇的濃度大于50%時(shí)，阿魏酸的洗脫量變化不大，但雜質(zhì)增多，為了保證有效成分盡可能轉(zhuǎn)移且純化物中有效組分的含量，最后決定選用50%乙醇作為川芎的洗脫液。

川芎的化學(xué)成分包括揮發(fā)油、酚酸類、多糖類、生物堿等，而其主要有效成分阿魏酸的含量僅0.10%左右[10-11]，所以阿魏酸的富集、精制、純化存在一定的難度。使用大孔吸附樹脂富集純化阿魏酸，能大大提高純化后總固體物中阿魏酸含量（近100倍）。因此無論是從精制程度、解吸附方面，還是從結(jié)果分析來看，大孔吸附樹脂法適用于川芎中阿魏酸的純化。

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