液體黑木耳菌種污染的快速鑒別

摘要 通過(guò)液體培養(yǎng)基中對(duì)木耳菌絲和常見(jiàn)的幾種雜菌菌絲的培養(yǎng)，用顯微攝像技術(shù)觀察比較其菌絲形態(tài)特點(diǎn)。結(jié)果表明，通過(guò)顯微技術(shù)比較液體培養(yǎng)基中的菌絲特點(diǎn)能清楚地區(qū)分出木耳液體培養(yǎng)基中的雜菌苗絲。

關(guān)鍵詞 黑木耳；液體；菌種；污染；鑒別

中圖分類(lèi)號(hào) S646.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）17-05448-03

木耳Auricularia auriculajudae，屬于擔(dān)子菌門(mén)Basidiomycota，傘菌綱Agaricomycetes，木耳目Auriculariales，木耳科Auriculariaceae，其肉質(zhì)細(xì)膩，營(yíng)養(yǎng)豐富，含有人體必需的多種氨基酸、肝糖、維生素和礦質(zhì)元素等，并具有降血脂、抗血栓、降血糖、清肺益氣、補(bǔ)血活血、鎮(zhèn)靜止痛等功效，是一種天然的食藥兼用菌[1-3]。

隨著食用菌栽培數(shù)量的不斷增加，菌種的培養(yǎng)成為重中之重。而液體菌種的培養(yǎng)與運(yùn)用正不斷為食用菌栽培者所運(yùn)用。由于栽培者在技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)方面的欠缺對(duì)菌種的標(biāo)準(zhǔn)制作工藝和流程細(xì)節(jié)很難掌握，液體菌種的廣泛應(yīng)用還存在一定的局限性。傳統(tǒng)菌種生產(chǎn)工藝，一般是由試管母種擴(kuò)繁成二級(jí)種、三級(jí)種，生產(chǎn)周期長(zhǎng)、污染率高、成本高、需要大量人工、管理困難[4]。

液體菌種與固體菌種相比具有純度高、活力強(qiáng)、萌發(fā)快、便于集中、快速工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)勢(shì)，是食用菌生產(chǎn)的方向[4]。液體菌種生產(chǎn)在國(guó)外已有很長(zhǎng)的歷史，在我國(guó)也曾進(jìn)行過(guò)，由于存在菌種單核化、設(shè)備投資過(guò)高等問(wèn)題推廣較慢[4]。相對(duì)于黑木耳菌種的液體培養(yǎng)，由于木耳菌絲比側(cè)耳類(lèi)的菌絲生產(chǎn)慢，菌絲生長(zhǎng)較弱的特點(diǎn)，在培養(yǎng)中易感染雜菌，由于生長(zhǎng)速度不同，雜菌生長(zhǎng)快，培養(yǎng)基很快被雜菌占滿(mǎn)，如果接種前沒(méi)有對(duì)菌種進(jìn)行雜菌檢查，其損失不可估量。筆者根據(jù)生產(chǎn)中常見(jiàn)的幾種易污染的雜菌特點(diǎn)與黑木耳菌菌絲在液體培養(yǎng)基中特點(diǎn)進(jìn)行了對(duì)比，為液體菌種的推廣提供建議。

1 材料與方法

1.1 菌種 黑木耳菌種（豐收2號(hào)），酵母菌（釀酒酵母），霉菌（青霉、曲霉、根霉），枯草桿菌，以上菌種保存于長(zhǎng)春師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

培養(yǎng)基：PDA液體培養(yǎng)基。

培養(yǎng)方法：搖床培養(yǎng)，溫度25 ℃，轉(zhuǎn)速160 rin，培養(yǎng)7 d。

檢測(cè)方法：顯微照相系統(tǒng)，在放大400～1 000倍鏡下觀察。

1.3 光學(xué)顯微結(jié)構(gòu)觀察

在超凈工作臺(tái)內(nèi)挑取少量不同菌齡的菌絲于載玻片上，滴0.2 ml 5%結(jié)晶紫染液，用接種針將菌絲完全拉開(kāi)，蓋好蓋玻片，靜置5 min，待整個(gè)菌絲完全染色后，置于1 000 倍顯微鏡下觀察并拍照[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 木耳菌絲的形態(tài)特點(diǎn) 黑木耳是一種大型真菌，由菌絲體和子實(shí)體組成。菌絲體無(wú)色透明，由許多具橫隔和分支的管狀菌絲組成[6]。子實(shí)體是由朽木內(nèi)的菌絲體發(fā)育而成，初時(shí)圓錐形、黑灰色、半透明（圖1、2）。

黑木耳除有性生活周期外，還有單核菌絲和雙核菌絲的無(wú)性生活周期[7]。雙核菌絲能斷裂形成雙核分生孢子或脫雙核化形成單核分 生孢子，在條件適宜時(shí)，都能分別萌發(fā)成單核菌絲或雙核菌絲，進(jìn)入上述有性的生活周期（圖1、2）， 最為明顯的為形成的索狀聯(lián)合（圖1中箭頭所指下方、圖3）。

2.2 常見(jiàn)的霉菌菌絲的特點(diǎn)

霉菌指一類(lèi)絲狀的真菌，霉菌的菌絲分為兩類(lèi)，即無(wú)隔膜菌絲和有隔膜菌絲[8]。在固體培養(yǎng)基上，營(yíng)養(yǎng)菌絲是伸入培養(yǎng)基內(nèi)吸收營(yíng)養(yǎng)成分的部分菌絲；生長(zhǎng)在空氣中的菌絲為氣生菌絲，而氣生菌絲發(fā)育到一定階段，成為繁殖菌絲。霉菌菌絲在顯微鏡下是一種透明的管狀細(xì)絲，直徑為3～10 μm（圖4、5），根據(jù)菌絲中是否存在隔膜，可把霉菌菌絲分成無(wú)隔膜菌絲和有隔膜菌絲2種類(lèi)型[9-10]。

2.2.1 無(wú)隔膜菌絲。菌絲中無(wú)隔膜，整團(tuán)菌絲體就是一個(gè)單細(xì)胞，其中含有多個(gè)細(xì)胞核。這是低等真菌（即鞭毛菌亞門(mén)和接合菌亞門(mén)中的霉菌）所具有的菌絲類(lèi)型[9-10]。常見(jiàn)的為根霉、毛霉等（圖4，6～8）。

2.2.2 有隔膜菌絲。菌絲中有隔膜，被隔膜隔開(kāi)的一段菌絲就是一個(gè)細(xì)胞，菌絲體由多個(gè)細(xì)胞組成，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)有1個(gè)或多個(gè)細(xì)胞核[9-10]。這是高等真菌（即子囊菌亞門(mén)和半知菌亞門(mén)中的霉菌）所具有的菌絲類(lèi)型。常見(jiàn)菌為青霉、曲霉，種類(lèi)多，數(shù)量廣，有發(fā)達(dá)的菌絲體，有隔膜，多細(xì)胞（圖5、9）。

2.2.3 木耳菌絲與霉菌菌絲的區(qū)別。木耳菌絲最直觀的特點(diǎn)，也是擔(dān)子菌綱的特點(diǎn)，菌絲上都有一菌索（圖1）和索狀聯(lián)合（圖1箭頭指處）。而在被霉菌污染的培養(yǎng)基中除能見(jiàn)到無(wú)隔的菌絲，菌絲中沒(méi)有隔，為一個(gè)中空透明的菌絲（圖7）。還具有在菌絲團(tuán)或菌絲的一端有孢子囊（圖10）。液體培養(yǎng)基還常夾雜有孢子（圖6）。而有隔菌絲在液體培養(yǎng)基中的菌絲片斷，通常呈竹節(jié)形，細(xì)胞內(nèi)有的單核或多核，有的不明顯（圖5～6）。黑木耳菌絲片斷中細(xì)胞內(nèi)的單核或雙核，且核較大（圖2）。

2.3 酵母菌與細(xì)菌的特點(diǎn)與區(qū)別

2.3.1 光學(xué)顯微鏡下單細(xì)胞真菌——酵母菌。酵母菌細(xì)胞的形態(tài)通常有球形、卵圓形、臘腸形、橢圓形、檸檬形或藕節(jié)形等[5]。比細(xì)菌的單細(xì)胞個(gè)體要大得多，一般為1～5 μm～5～20 μm，酵母菌無(wú)鞭毛，不能游動(dòng)。最典型常見(jiàn)的酵母菌為酵酒酵母（圖11、12）。

2.3.2 細(xì)菌的光鏡下形態(tài)特點(diǎn)。

細(xì)菌是一類(lèi)細(xì)胞細(xì)而短（細(xì)胞直徑約0.5 μm，長(zhǎng)度0.5～5 μm）、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、細(xì)胞壁堅(jiān)韌、以二等分裂方式繁殖和水生性較強(qiáng)的原核微生物[9-10]。普通的光鏡（10×100）可以把細(xì)菌的形態(tài)放大得很清楚（圖13），但要想看清其細(xì)胞器需要電鏡的協(xié)助。

2.3.3 酵母菌與細(xì)菌的區(qū)別。首先是酵母菌要比細(xì)菌大，酵母菌具有細(xì)胞核而細(xì)菌沒(méi)有細(xì)胞核，只有擬核也就是核區(qū)，如果酵母菌在進(jìn)行出芽繁殖，可以清晰看到從菌體長(zhǎng)出的芽，有些細(xì)菌具有鞭毛，而酵母菌不具有鞭毛，最明顯的是酵母菌有細(xì)胞核而細(xì)菌沒(méi)有細(xì)胞核且酵母菌內(nèi)有細(xì)胞器包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等，細(xì)菌沒(méi)有細(xì)胞器，雖然只有核糖體但極微小，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察不到（圖12、13）。

2.3.4 液體木耳培養(yǎng)基中酵母菌與細(xì)菌的區(qū)別。液體培養(yǎng)基中酵母菌與細(xì)菌如同木耳菌的“孢子”，但這所謂的“孢子”從大小形態(tài)上有很多區(qū)別，首先是形態(tài)上酵母菌個(gè)體較大，且在光鏡下具有明顯的核，而細(xì)菌個(gè)體小，但密度高，有規(guī)則的桿形和球形。在液體培養(yǎng)過(guò)程中，木耳菌絲不產(chǎn)生孢子，由于不斷地機(jī)械攪拌，菌絲體不斷地?cái)嗔?，表現(xiàn)為無(wú)性繁殖，液體中充滿(mǎn)了菌絲片斷。如果液體培養(yǎng)基中出現(xiàn)了球形或桿形的個(gè)體，就要進(jìn)行仔細(xì)檢查，是否污染了細(xì)菌與酵母菌（圖14）。

3 小結(jié)

菌種染菌對(duì)木耳液體菌種的影響重大，關(guān)系到木耳生產(chǎn)的成敗。液體菌種生產(chǎn)過(guò)程中的菌種污染是指在液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)程中侵入了生產(chǎn)菌以外的其他雜菌。菌種染菌對(duì)培養(yǎng)過(guò)程的影響可以從以下兩方面理解：首先，由于各種液體培養(yǎng)所用的菌種、培養(yǎng)基以及培養(yǎng)條件、產(chǎn)物性質(zhì)的不同， 發(fā)生染菌后，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分被消耗或代謝產(chǎn)物被分解，嚴(yán)重影響到新生菌絲的生成，導(dǎo)致液體菌種培養(yǎng)的失敗。其次，在種子培養(yǎng)期染菌，由于此時(shí)菌體濃度低，培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富，較易染菌。此時(shí)一旦染菌，必須重新制做培養(yǎng)基，重新接種，重新培養(yǎng)菌。

培養(yǎng)過(guò)程中不同染菌時(shí)期分析：在菌種培養(yǎng)的前期染菌，由于菌體處于生長(zhǎng)繁殖階段，菌體量少，生長(zhǎng)慢，培養(yǎng)基感染雜菌后，雜菌生長(zhǎng)的速度高于木耳菌絲的生長(zhǎng)速度，與木耳菌爭(zhēng)奪培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，嚴(yán)重干擾生產(chǎn)菌的正常生長(zhǎng)、繁殖及產(chǎn)物的生成。在菌種培養(yǎng)的中期染菌，易導(dǎo)致菌體自溶，培養(yǎng)基產(chǎn)生大量泡沫，培養(yǎng)的菌絲體物質(zhì)減少，此時(shí)期的染菌危害最大，一旦發(fā)現(xiàn)應(yīng)盡快處理。在菌種培養(yǎng)的后期染菌，此時(shí)培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)基本已耗盡，且培養(yǎng)的產(chǎn)物已有較多的積累，此時(shí)期染菌很難發(fā)現(xiàn)。菌種培養(yǎng)是食用菌生產(chǎn)中最關(guān)鍵的一步，如果接種前沒(méi)有對(duì)菌種進(jìn)行雜菌檢查，一旦接菌使用產(chǎn)生的危害，其損失不可估量。

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