抗浪魚MC4R基因的PCR擴(kuò)增及序列分析

摘要 [目的]對抗浪魚MC4R基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。[方法]采用PCR方法，依據(jù)鯽魚的黑素促黑素受體4（MC4R）基因保守區(qū)的核苷酸序列，采用引物設(shè)計軟件，對抗浪魚的MC4R基因設(shè)計出一對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和純化測序，并利用phylip軟件對抗浪魚和其他已知MC4R基因序列的魚類構(gòu)建基因進(jìn)化樹。[結(jié)果]抗浪魚MC4R基因的擴(kuò)增長度為1 001 bp。9種魚類的MC4R核苷酸序列聚為2大類。其中，比目魚單獨(dú)聚為一類；斑劍尾魚、舌齒鱸、白斑角鯊、斑馬魚、抗浪魚、黑青斑河豚、中華多紀(jì)豚和紅旗東方豚聚為一類。[結(jié)論]抗浪魚與斑馬魚的親緣關(guān)系最近，與比目魚的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

關(guān)鍵詞 抗浪魚；MC4R基因；多聚酶鏈反應(yīng)；進(jìn)化樹

中圖分類號 S188 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）17-05385-02

Abstract [Objective] MC4R gene from Schizothorax taliensis was amplified by PCR method. [Method] The primers were designed by the conservative MC4R of Crucian carp gene sequence. After the purification and sequencing， polygenetic tree for MC4R gene of Schizothorax taliensis and other fish species was constructed using phylip software. [Result] The MC4R gene of Schizothorax taliensis is 1 001 bp in length. MC4R nucleotide sequences of 9 fish species were clustered into 2 categories. Paralichthys olivaceus clustered into a separate category， Poeciliidae， Dicentrarchus labrax， Squalus acanthias， zebra fish， Schizothorax taliensis， black spot puffer， black spot puffer and red fugu belonged to another category. [Conclusion] The closest relative is zebra fish and the relationship of the farthest grouper is Paralichthys olivaceus.

Key words Schizothorax taliensis； MC4R gene； PCR； Polygenetic tree

抗浪魚，原名鱇魚浪白魚（Anabrilius grahami），屬鯉形目（Cypriniformes）鯉科（Cyprinidae）鮊亞科（Cultrinae）白魚屬（Anabarilius），是云南特有的4大土著名魚之一。抗浪魚僅分布于我國的撫仙湖，歷史上產(chǎn)量曾占撫仙湖總漁產(chǎn)量的70%～80%，足見其在漁業(yè)中的重要地位，是產(chǎn)地重點保護(hù)和發(fā)展的主要對象[1]。

黑素促黑素受體-4（MC4R）屬于黑素促黑素家族的一員。MC4R具有介導(dǎo)瘦素（leptin）蛋白的功能，是一個調(diào)節(jié)能量平衡與能量動態(tài)平衡的重要信號分子[2]，具有控制動物食欲、體重和能量代謝等作用[3]。1997年，Huszar等對敲除MC4R基因的小鼠進(jìn)行了研究[4]，發(fā)現(xiàn)敲除MC4R基因的小鼠出現(xiàn)遺傳性肥胖，表現(xiàn)出多食、胰島素分泌過多以及肥胖等癥狀。MC4R可與腦部分泌的天然內(nèi)原配體α促黑激素（alpha melanocyte stimulating hormone ，αMSH）結(jié)合，抑制攝食，導(dǎo)致血糖降低、低胰島素和瘦素水平，從而減少體脂，降低體重，是一個調(diào)節(jié)動態(tài)平衡的重要信號分子[5-6]。近年來，MC4R基因在介導(dǎo)肥胖癥中發(fā)揮的作用越來越受到人們的關(guān)注。Ringholm A[7]等研究指出，金魚MC4R基因（gMC4R）在攝食上發(fā)揮作用，根據(jù)同源性比對，金魚MC4R基因與人MC4R基因有68%相同，并且保存了重要功能領(lǐng)域。金魚MC4R基因還參與體色的控制。其他魚類如河豚魚、斑馬魚、翻車魚、鯉魚中也有MC4R基因序列。將MC4R基因作為一個候選基因用于篩選與動物生長性狀相關(guān)聯(lián)的單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphisms，SNPs）位點已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。劉福平[8]等在對羅非魚MC4R基因克隆及與其生長相關(guān)的SNPs位點的分析中，對羅非魚MC4R基因啟動子和外顯子區(qū)域進(jìn)行了SNPs位點的檢測和分型，結(jié)果共檢測到5個SNPs位點。

生物基因進(jìn)化樹是生物學(xué)家根據(jù)生物進(jìn)化序列制成的樹狀結(jié)構(gòu)，微觀分子水平上的進(jìn)化樹（基因樹）是20世紀(jì)50年代分子生物學(xué)問世之后形成的，可使人們直觀、簡明地認(rèn)識地球上生物之間的親緣和進(jìn)化關(guān)系。如能找到影響抗浪魚體重增長的基因無疑會帶來巨大的經(jīng)濟(jì)價值和研究價值。試驗根據(jù)鯽魚的MC4R基因保守區(qū)的核苷酸序列設(shè)計1對引物，對抗浪魚的MC4R基因進(jìn)行提取、PCR擴(kuò)增、測序，并與其他魚類進(jìn)行同源性分析，構(gòu)建基因進(jìn)化樹，以期為進(jìn)一步了解抗浪魚MC4R基因的功能提供基礎(chǔ)，并為抗浪魚MC4R基因的SNPs檢測和分型以及對抗浪魚的分子標(biāo)記輔助育種提供理論基礎(chǔ)，為抗浪魚的種群恢復(fù)提供幫助。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物?？估唆~，為云南澄江撫仙湖中的野生個體。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取。采用常規(guī)苯酚法抽提抗浪魚基因組DNA。

1.2.2 MC4R基因PCR擴(kuò)增。用于MC4R基因多態(tài)檢測的引物序列參照文獻(xiàn)進(jìn)行合成。引物由上海生工公司合成。其序列為：上引：5’TCATACCGAAATCACAGC3’，下引：5’TCAACATCTATCTCCCAAAC3’。PCR反應(yīng)體系為：水38.5 μl，10×Buffer 6 μl，dNTP 2 μl，上引物0.6 μl，下引物0.6 μl，DNA模板2 μl，Taq酶0.4 μl。

1.2.3 反應(yīng)條件。92 ℃預(yù)變性8 min，92 ℃變性50 s，53 ℃退火50 s，72 ℃延伸65 s，共35循環(huán)；之后72 ℃后延伸8 min。PCR產(chǎn)物送由金瑞斯生物科技有限公司測序檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA的檢測

2.1.1 檢測結(jié)果。取溶解的抗浪魚的基因組DNA在含EB的1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳條件問130 V，35 min。在凝膠成像儀上觀察結(jié)果并掃描，結(jié)果見圖1。

3 結(jié)論與討論

研究表明，MC4R基因在動物體內(nèi)下丘腦、胰腺、胃均有表達(dá)[9]，具有控制食欲、調(diào)節(jié)能量平衡的作用[10]。試驗獲得了完整的編碼區(qū)序列，測序結(jié)果顯示，抗浪魚MC4R基因的擴(kuò)增長度為1 001 bp，外顯子996 bp。

試驗利用phylip軟件對抗浪魚和其他已知MC4R基因序列的魚類構(gòu)建了基因進(jìn)化樹并進(jìn)行分析。根據(jù)圖譜顯示，M9和M8分別為紅旗東方豚和中華多紀(jì)豚，屬于同一物種，與M7黑青斑河豚是一個屬，從而證明試驗所采用的phylip軟件分析方法是正確的。也就是說，此進(jìn)化樹圖譜具有一定科學(xué)性，可信度高。

經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)抗浪魚與比目魚的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，與斑馬魚的親緣關(guān)系最近。首先，抗浪魚與斑馬魚的親緣關(guān)系近，2種魚類的生活習(xí)性可能類似，那么抗浪魚是否可以向斑馬魚一樣生活在暖海域的沿岸，具有夜行性，特別是利用其嗅覺尋覓食物的特性，這是一個值得研究的課題；同時，可以嘗試將斑馬魚引進(jìn)放入撫仙湖中的環(huán)境下養(yǎng)殖。這種思路對其他魚類也有借鑒意義。其次，抗浪魚價格昂貴，生長緩慢，資源缺乏，有義務(wù)對其進(jìn)行保護(hù)。然而在試驗和開發(fā)的同時，避免不了捕捉抗浪魚。根據(jù)抗浪魚與其他魚類的親緣關(guān)系，如果努力找到親緣關(guān)系近，數(shù)量多，易成活，繁殖率高的魚類來代替抗浪魚做相關(guān)的研究。這對抗浪魚的保護(hù)具有重要的意義。

由此類推，撫仙湖魚類資源豐富，若對撫仙湖中的魚類進(jìn)行基因分析和構(gòu)建基因進(jìn)化樹找到魚類之間的親緣關(guān)系，可以找到物種間的進(jìn)化關(guān)系，可以找到撫仙湖魚類的起源，斷定魚類是否屬于該地土著魚種還是引進(jìn)魚種，同時還可以進(jìn)行魚類生活與撫仙湖水質(zhì)環(huán)境的關(guān)系研究。抗浪魚的這一研究對此都有重大的指導(dǎo)意義和應(yīng)用意義。

試驗根據(jù)鯽魚的MC4R基因保守區(qū)的核苷酸序列，采用引物設(shè)計軟件，對抗浪魚的MC4R基因設(shè)計出一對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后純化測序，

測序結(jié)果顯示，抗浪魚MC4R基因的擴(kuò)增長度為1 001 bp。同時利用phylip軟件對抗浪魚和其他已知MC4R基因序列的魚類構(gòu)建了基因進(jìn)化樹并進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗浪魚與比目魚的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，與斑馬魚的親緣關(guān)系最近，從而為進(jìn)一步了解抗浪魚MC4R基因的功能提供基礎(chǔ)，便于研究抗浪魚與其它魚類的親緣與進(jìn)化關(guān)系，為抗浪魚MC4R基因的SNPs檢測和分型以及對抗浪魚的分子標(biāo)記輔助育種提供前提理論基礎(chǔ)，為抗浪魚的種群恢復(fù)提供一定的幫助。

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