云南4個地方雞種PRL外顯子5基因多態(tài)性研究

摘要 [目的]研究云南4個地方雞種PRL外顯子5基因的多態(tài)性。[方法]對云南地方雞種剝隘小種雞（BA）、大圍山微型雞（DW）、武定雞（WD）、鹽津烏骨雞（YJ）4個雞種PRL基因第5外顯子PCRSSCP進(jìn)行檢測分析，并采用Progene，Editplus等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。[結(jié)果]PCRSSCP檢測分析發(fā)現(xiàn)，PRL外顯子5有4個SNP位點，均有多種基因型。在PRLexon5 681、742和816 bp處呈現(xiàn)基因多態(tài)性，剝隘小種雞、武定雞、鹽津烏骨雞有AA、BB和AB 3種基因型，大圍山微型雞有AA和AB 2種基因型。PRLRexon5 950 bp處有1個SNP，4種雞均有AA、BB和AB 3種基因型。[結(jié)論]A基因可能是影響繁殖性狀的優(yōu)勢基因。

關(guān)鍵詞 云南地方雞種；PRL基因；PCRSSCP

中圖分類號 S831 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）17-05374-03

Abstract [Objective] To study PRL exon 5 gene polymorphism of four Yunnan indigenous chicken. [Method] PCRSSCP detection was conducted on PRL exon 5 gene of four Yunnan indigenous chicken（BA， DW， WD， YJ）， and data analysis was carried out by Progene and Editplus software. [Result] PRL exon 5 gene has four SNP sites， all have a variety of genotypes. The results showed that PRLexon5 681 bp and 742 bp and 816 bp has gene polymorphism， the breeds of BA， DW and WD have AA， BB， AB 3 genotype， the breeds of YJ have AA， AB genotypes. PRLRexon5 950 bp has one SNP site， the four chicken breeds have AA， BB， AB 3 gene type. [Conclusion] The results showed that the gene A may be the dominant genes which affect the reproductive traits.

Key words Yunnan indigenous chicken； PRL gene； PCRSSCP

催乳素是垂體前葉嗜酸性細(xì)胞分泌的多肽類激素，催乳素是垂體前葉嗜酸細(xì)胞分泌的多膚類激素，根據(jù)PRL基因敲除的動物模型，PRL是產(chǎn)乳和繁殖等功能所必需的[1]。Wong[2]等發(fā)現(xiàn)，抱窩時垂體PRL的mRNA和PRL含量分別為正常時的50倍和3倍。同時，下丘腦促性腺激素釋放激素GnRH（I及Ⅱ型）和垂體促黃體激素LH-B的mRNA減少。注射外源PRL除誘發(fā)抱窩行為外[3]，還導(dǎo)致性腺萎縮；血液中LH、睪酮和雌二醇含量下降；卵泡膜細(xì)胞芳香化酶mRNA顯著減少[4-5]。催乳素與家禽繁殖性狀密切相關(guān)，Miao and Burt（1999）將雞的PRL基因定位于2號染色體。筆者分析PRLexon5基因的多態(tài)性，旨在為云南地方雞種基因多態(tài)性的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗雞群及樣品采集

所用的試驗雞群是飼養(yǎng)于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)實習(xí)雞場隨機(jī)挑選的體質(zhì)健康、生長正常的武定雞、鹽津烏骨雞、大圍山微型雞、剝隘小種雞4種雞種母雞50只（19周齡），試驗雞群在完全相同的飼養(yǎng)管理條件和相同營養(yǎng)水平環(huán)境下單籠飼養(yǎng)。采用靜翅采血方法在每只雞身上采集約2 ml血樣，記錄編號，保存于真空采血管（含抗凝劑）中，置于冰盒，帶回實驗室存于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA提取

采用全血基因組DNA快速提取試劑盒進(jìn)行基因組DNA的提取。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。

1.3 PCR擴(kuò)增

根據(jù)Ensembl數(shù)據(jù)庫中cPRL的全長DNA序列（登錄號：ENSGALG00000012671）應(yīng)用Primer Primier3和Oligo6，篩選出GC含量相近、擴(kuò)增片段長度和范圍適宜、不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)和二聚體的序列。進(jìn)行測序引物合成，引物由昆明毓秀生物公司合成，合成片段421 bp。上游引物序列：5’TTGCAGAACAAAGGGAGACA3’；下游引物序列：5’AAGGTATAAGCCATCCCAGCTA3’。PCR反應(yīng)體系中Master mix緩沖液購自昆明毓秀生物公司，反應(yīng)體系采用25 μl體系，參數(shù)如下：模版2 μl DNA，10 μl ddH2O，11 μl Master mix，1 μl Primer F，1 μl Primer R。

1.4 PCR反應(yīng)操作步驟

94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸 120 s，72 ℃延伸10 min；2～4步驟進(jìn)行35個循環(huán)。

1.5 瓊脂糖電泳檢測

采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，所用的DNA Marker1購自昆明毓秀生物公司；參照片段由小到大依次是100、200、300、400、500、600和700 bp；Marker1點樣量為3 μl，PCR產(chǎn)物的點樣量為3 μl；DNA染料GOLD VIEW按1∶ 40混至瓊脂糖凝膠。UVP紫外透射儀凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果并照相。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用DNA直接測序進(jìn)行基因型分析，Popgene和Eidtplus進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增

圖1表明，1～11泳道PCR產(chǎn)物特異性較好，條帶亮度較好擴(kuò)增片段大約在421 bp，結(jié)果表明，試驗?zāi)康钠慰捎谩?/p>

2.2 PRL第5外顯子檢測

對PRLexon5基因進(jìn)行測序，根據(jù)Genebank Blast進(jìn)行搜索比對，發(fā)現(xiàn)有4處SNP。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該片段在681 bp處有一個T→C的突變，測序產(chǎn)生3種基因型（圖2）；氨基酸編碼區(qū)沒有造成氨基酸突變。在742 bp處有一個G→C的突變，測序產(chǎn)生3種基因型（圖3），氨基酸編碼區(qū)由GTG→CTG，由纈氨酸（Val）突變?yōu)榱涟彼幔↙eu）；在816 bp處有一個C→T的突變，測序產(chǎn)生3種基因型，氨基酸編碼區(qū)由TAC→TAT，沒有造成氨基酸突變（圖4）。在950 bp處有一個C→T的突變，測序產(chǎn)生3種基因型（圖5），氨基酸編碼區(qū)由CTT→CCT，由亮氨酸（Leu）突變?yōu)楦彼幔≒ro）。

2.3 PRL第5外顯子SNP基因頻率、基因型頻率

從群體遺傳學(xué)角度分析統(tǒng)計了4種雞群體在PRLexon5的4對分段引物對PRL基因擴(kuò)增片段的基因型、等位基因頻率（表1）。由表1可知，在681 bp處，對于4種雞，基因T的頻率較基因C的頻率占優(yōu)勢，TT基因型為優(yōu)勢基因型；在742 bp處，基因G的頻率較基因C的頻率占優(yōu)勢，GG基因型為優(yōu)勢基因型；在816 bp處，基因C的頻率較基因T的頻率占優(yōu)勢，CC基因型為優(yōu)勢基因型；在950 bp處，基因C的頻率較基因T的頻率占優(yōu)勢，CC基因型為優(yōu)勢基因型。剝隘小種雞、武定雞、鹽津烏骨雞在681、742和816 bp處均有AA、BB、AB 3種基因型存在，而大圍山微型雞只有AA和AB 2種基因型。在950 bp處，4種雞均有AA、AB和BB 3種基因型。

2.4 PRL第5外顯子多態(tài)信息量（PIC）、純合度（Ho）、雜合度（He）、卡方檢驗

對于一個群體而言，PIC（PIC>0.5為高度多態(tài)，0.250.5，大圍山微型雞在681、742、816 bp處為低度多態(tài)，在950 bp處為中度多態(tài)。剝隘小種雞、武定雞、鹽津烏骨雞在681、742、816、950 bp處雜合度較高，而鹽津烏骨雞雜合度比較低。經(jīng)過卡方檢驗，發(fā)現(xiàn)在681、742、816 bp處4種雞均處于Hardyweinberg平衡（P>0.05），在950 bp剝隘小種雞、大圍山微型雞、武定雞處于Hardyweinberg平衡（P>0.05），鹽津烏骨雞處于非Hardyweinberg平衡（P<0.05）。

3 結(jié)論與討論

武定雞、鹽津烏骨雞、剝隘小種雞、鹽津烏骨雞均是云南地方的有名雞種，具有早熟易肥，肌纖維細(xì)，肉質(zhì)鮮美，香味濃郁，滑嫩異常等優(yōu)異的特征而著稱。試驗探索了武定雞、鹽津烏骨雞、剝隘小種雞、鹽津烏骨雞4個品種中PRL基因頻率、基因型頻率、多肽信息含量、雜合度以及哈溫平衡的分布情況，為我國地方優(yōu)質(zhì)雞的繁殖性能的改良和分子育種繁殖提供了理論依據(jù)。

在家禽中，基因多態(tài)性的研究是一個熱點，僅PRL基因多態(tài)性方面的研究成果已有可觀的研究成果。如季華[6]在內(nèi)含子2上發(fā)現(xiàn)在在55 bp有一個T/C突變，該位點沒有引起氨基酸發(fā)生變化。洪坤月[7]發(fā)現(xiàn)在PRL基因調(diào)控區(qū)-378～-355 bp處的PRL pro位點存在24 bp的突變，在太湖雞檢測到一個SNP位點A269G。耿照玉等[8]發(fā)現(xiàn)PRL基因外顯子2的單核苷酸變異產(chǎn)生3種基因型，且在有一個SNPC67T導(dǎo)致Met轉(zhuǎn)變?yōu)閂al。趙興濤等[9]對五龍鵝研究發(fā)現(xiàn)，PRL內(nèi)含子2有3種基因型，1個SNP位點，由第38和39位點上GA堿基的插入/缺失產(chǎn)生。張高娜等[10]研究發(fā)現(xiàn)，PRL5′調(diào)控區(qū)有CC、DD 2種基因型，未檢測到CD型；對不同基因型個體測序還發(fā)現(xiàn)，在外顯子1上游﹢11處發(fā)現(xiàn)了一個G→T突變，等。在眾多對家禽基因多態(tài)性研究的相關(guān)文獻(xiàn)內(nèi)，未發(fā)現(xiàn)與本研究相同的SNP位點。

試驗結(jié)果表明，在剝隘小種雞、大圍山微型雞、武定雞和鹽津烏骨雞681、742、816、950 bp大部分具有中度PIC，中度雜合度且Hardyweinberg平衡，表明這4個SNP位點從基因序列保守性來說，比較強(qiáng)，在品種的選育、遷徙和遺傳漂變等因素作用下處于動態(tài)平衡當(dāng)中，它們的遺傳是隨機(jī)的；基因頻率的平衡對于群體穩(wěn)定性有著直接的保證作用。另外，由于研究過程中，僅限于實驗室的分子理論方面，未能夠與家禽實際繁殖性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，在基因與性狀的關(guān)聯(lián)分析方面有待進(jìn)一步的研究與探索。云南地方雞種與其他地方雞種在PRLexon5處的區(qū)別和差異性有待進(jìn)一步的研究比較， 豐富基因多態(tài)性的研究，為地方雞種的選育，繁殖等方面做出貢獻(xiàn)，這都是以后可逐漸開展的研究方向。

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