成都平原主養(yǎng)草魚(yú)·搭配鯽魚(yú)池塘底泥中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

摘要 [目的]分析成都平原主養(yǎng)草魚(yú)、搭配鯽魚(yú)池塘底泥中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。[方法] 通過(guò)構(gòu)建細(xì)菌16S rRNA基因克隆文庫(kù)，對(duì)陽(yáng)性克隆子進(jìn)行多樣性分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。[結(jié)果] 依據(jù)97%序列相似性劃分OUT，所構(gòu)建的文庫(kù)共獲得171個(gè)克隆子，并劃分為14個(gè)OTUs（操作分類(lèi)單元），其多樣性指數(shù)Shannon（H）和優(yōu)勢(shì)度指數(shù)Simpson（D）分別為2.12和7.15，豐富度指數(shù)SChao1和SACE均為16。池塘底泥中主要的細(xì)菌類(lèi)群為：梭桿菌門(mén)（24%）、變形菌門(mén)（55%）、浮霉菌門(mén)（10.5%）、綠彎菌門(mén)（5.9%）、擬桿菌門(mén)（2.3%）、放線菌門(mén)（1.8%）和厚壁菌門(mén)（0.6%）。 [結(jié)論]Cetobacterium 、Prolixibacter、Rhodocyclus、Candidate、Planctomycetacia、Thiocapsa、Desulfomicrobium和Sterolibacterium等屬菌在脫氮除磷、降低硫化物、降解有機(jī)質(zhì)等發(fā)揮重要作用。池塘底泥既是水生態(tài)系統(tǒng)修復(fù)功能菌的資源庫(kù)，但也存在著Xanthomonas等致病性和功能未知的細(xì)菌庫(kù)。

關(guān)鍵詞 草魚(yú)、鯽魚(yú)；池塘底泥；16S rRNA；細(xì)菌多樣性

中圖分類(lèi)號(hào) S965.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）17-05477-04

Abstract [Objective] The paper was to investigate bacterial community structure in Chengdu fishfarm sediment stocked with dominated Grass Carp and subordinate Crucian. [Method] Through the construction of 16S rRNA cloning library of bacteria， the positive clone was carried out community diversity analysis， and the phylogenetic tree was constructed. [Result] OUT （Operational Taxonomic Units） was classified according to sequences similarity of 97%， all 171

clones were clustered into 13 OTUs. The richness index Schao1 and SACE were 16 and 16， and the dominancy index （D） and diversity index （H） were 2.12 and 7.15， respectively. All sequences were respectively fell into the phylum of Fusobacteria （24%）， Proteobacteria （55%）， Planctomycetes （10.5%）， Chloroflexi （5.9%）， Bacteroidetes （2.3%）， Actinobacteria （1.8%） and Firmicutes （0.6%）. [Conclusion] The members of Cetobacterium， Prolixibacter， Rhodocyclus， Candidate， Planctomycetacia， Thiocapsa， Desulfomicrobium and Sterolibacterium play a key role in denitrogenation， phosphorus and sulfate reducing and organics degradation， while the Xanthomonas was an plant pathogen， this result suggested that the sediment was not only a bacterial source for ecological restoration， but also a reservoir for pathogenicity.

Key words Grass Carp and Crucian； Fishfarm sediment； 16S rRNA； Bacterial diversity

混養(yǎng)是指在同一個(gè)魚(yú)塘混合養(yǎng)殖多種魚(yú)類(lèi)。混養(yǎng)是提高池塘養(yǎng)魚(yú)產(chǎn)量的重要措施，也是目前我國(guó)池塘養(yǎng)魚(yú)的技術(shù)特色，目前已獲得了大面積推廣與應(yīng)用?；祓B(yǎng)具有以下優(yōu)點(diǎn)：①可以充分利用池塘各個(gè)水層，發(fā)揮水體生產(chǎn)潛力；②全面合理利用池塘天然餌料資源，提高餌料利用率；③發(fā)揮養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)之間的共生互利關(guān)系，改善池塘生態(tài)環(huán)境；④降低養(yǎng)殖成本，增加經(jīng)濟(jì)收入[1]。然而，由于淡水養(yǎng)殖池塘是半靜態(tài)、相對(duì)封閉的小型水體，自?xún)裟芰^弱[2]。投餌施肥、生物排泄與死亡殘骸的長(zhǎng)期積累使得高密度的混養(yǎng)養(yǎng)殖模式水體中有機(jī)質(zhì)含量超高[3]，致使自身的環(huán)境狀況發(fā)生惡化，降低水體的利用效率，也使健康養(yǎng)殖存在一定的風(fēng)險(xiǎn)，甚至當(dāng)養(yǎng)殖結(jié)束后養(yǎng)殖廢水的排放會(huì)影響周?chē)纳鷳B(tài)環(huán)境。長(zhǎng)期以來(lái)，許多學(xué)者對(duì)養(yǎng)殖系統(tǒng)中水質(zhì)狀況以及營(yíng)養(yǎng)收支平衡進(jìn)行了研究，以期達(dá)到養(yǎng)殖上以最小投入換來(lái)最大收益的目的，并提出通過(guò)改善餌料的加工及投喂方式來(lái)降低水質(zhì)的污染速率，但該方法存在成本高、易引起二次污染等缺點(diǎn)。因此，為了提高水產(chǎn)養(yǎng)殖質(zhì)量和效益，對(duì)人工養(yǎng)殖池塘生態(tài)系統(tǒng)尤其是池塘底泥微生物的研究已成為未來(lái)水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的研究熱點(diǎn)。

底泥微生物群落作為水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在能量流動(dòng)、物質(zhì)循環(huán)、水質(zhì)環(huán)境、疾病控制和污水管理等方面發(fā)揮著重要的作用[4]，此外也是評(píng)價(jià)養(yǎng)殖環(huán)境狀況的重要生物檢測(cè)指標(biāo)[5]。因此，對(duì)人工養(yǎng)殖系統(tǒng)底泥微生物的研究越來(lái)越受到水產(chǎn)行業(yè)及科研人員的重視。程瑩寅[4]、馬英[6]等分別采用16S rRNA文庫(kù)構(gòu)建方法對(duì)主養(yǎng)草魚(yú)池塘底泥微生物群落多樣性、對(duì)蝦養(yǎng)殖池沉積物細(xì)菌的遺傳多樣性進(jìn)行研究。蔡瑩[7]等在傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上對(duì)蝦池沉積物細(xì)菌的對(duì)太湖沉積物可培養(yǎng)方式進(jìn)行改進(jìn)并采用DGGE技術(shù)分析了蝦池沉積物細(xì)菌的多樣性。以上研究發(fā)現(xiàn)池塘底泥中微生物種類(lèi)及功能的復(fù)雜性，從池塘養(yǎng)殖系統(tǒng)來(lái)看，水體中微生物不僅包含有益菌，而且包含致病性微生物。在池塘底泥微生物利用方面，范立民[8]從吉富羅非魚(yú)養(yǎng)殖池塘底泥中分離出具有反硝化功能細(xì)菌脫氮硫桿菌。林亮[9]研究了芽孢桿菌對(duì)蝦池底泥細(xì)菌群落的影響，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌制劑能夠改善池塘底泥細(xì)菌類(lèi)群的組成，提高對(duì)蝦的成活率、體重和產(chǎn)量的提高。以上研究有助于了解池塘底泥微生物在水體凈化過(guò)程中作用，開(kāi)發(fā)利用微生物新資源?；诖?，筆者利用16S rRNA免培養(yǎng)法分析成都新津主養(yǎng)草魚(yú)、混搭鯽魚(yú)的混養(yǎng)模式池塘底泥中細(xì)菌多樣性及群落構(gòu)成。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2013年7月中旬，使用重力式采泥器分別在四川省成都市新津縣五津魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)采集主養(yǎng)草魚(yú)、搭配鯽魚(yú)池塘底部四角及中心部位采集底泥樣品，采集后樣品迅速密封，并置于干冰中運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，凍存于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 底泥樣品總DNA提取及16S rRNA基因PCR擴(kuò)增

分別稱(chēng)取10 g池塘四角及中心部位底泥于無(wú)菌離心管中，置于漩渦混合器上振蕩混勻，稱(chēng)取0.5 g混勻的底泥樣品，用E.Z.N.A. Soil DNA Kit （Omega， 美國(guó)）提取總DNA，具體方法參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。DNA抽提重復(fù)3次并混勻，以減少DNA在提取過(guò)程中產(chǎn)生的偏差。16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增條件及程序參考XIANG等描述方法[10]，將擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測(cè)，-20 ℃下保存。

1.3 16S rRNA 基因文庫(kù)的構(gòu)建

PCR產(chǎn)物經(jīng)（純化試劑盒）純化后，依據(jù)pGEMT Easy Vector SystemⅠ（美國(guó)Promega 公司）說(shuō)明書(shū)將PCR產(chǎn)物連接至pGEMT載體，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌E.coli JM109中，涂布于含氨芐青霉素、Xgal和IPTG的LB 平板上，篩選陽(yáng)性克隆子。

1.4 16S rDNA測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育分析

挑選陽(yáng)性克隆子，用Plasmid Mini Kit Ⅰ（美國(guó)Omega Inc）提取重組質(zhì)粒，采用菌落PCR方法檢測(cè)目的片段是否正確插入，挑選含有正確插入片段的重組質(zhì)粒送交上海華津生物科技有限公司測(cè)序。所獲得的序列用CLASSIFIER （RDP II， http：//rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp）進(jìn)行分類(lèi)，并提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中與已有序列經(jīng)Blast進(jìn)行同源性檢索后，從相同序列中選取代表序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中典型菌株序列一起使用MEGA5.0軟件中的Neighborjoining法進(jìn)行1 000次步長(zhǎng)計(jì)算構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[11]。

2.2 16S rRNA基因克隆文庫(kù)多樣性分析

所構(gòu)建的克隆文庫(kù)共獲得171個(gè)有效克隆序列，經(jīng)BioEdit軟件分析后共得到13個(gè)不同分類(lèi)操作單元（OTUs）。多樣性分析結(jié)果表明，該16S rRNA基因文庫(kù)的最大OTU豐富度指數(shù)SChao1和SACE均為16，多樣性指數(shù)（H）和優(yōu)勢(shì)度指數(shù)（D）分別為2.12和7.15，文庫(kù)覆蓋率為81.2%，可知該文庫(kù)體現(xiàn)了池塘底泥中大部分的細(xì)菌菌群的多樣性。從圖2可以看出，曲線上升幅度逐漸平緩，OTU個(gè)數(shù)增加的幅度隨著克隆子個(gè)數(shù)的增加而逐漸減小，表明文庫(kù)基本趨近飽和，文庫(kù)能覆蓋樣品中大部分的菌系，能夠真實(shí)反映樣品中細(xì)菌的多樣性。因此，構(gòu)建的16S rRNA克隆文庫(kù)能夠較好反映池塘底泥中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)。

3 討論

底泥細(xì)菌作為水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，不僅參與養(yǎng)殖系統(tǒng)中有機(jī)質(zhì)、無(wú)機(jī)鹽等物質(zhì)循環(huán)代謝及能量代謝，也影響?zhàn)B殖動(dòng)物消化系統(tǒng)微生物菌群結(jié)構(gòu)，因而與養(yǎng)殖動(dòng)物的健康狀況及水質(zhì)保持密切相關(guān)。為探明成都平原主養(yǎng)草魚(yú)、搭配鯽魚(yú)養(yǎng)殖池塘底泥中細(xì)菌群落多樣性及結(jié)構(gòu)，筆者通過(guò)構(gòu)建16S rRNA基因文庫(kù)分析了成都新津主養(yǎng)草魚(yú)、混搭鯽魚(yú)的混養(yǎng)模式池塘底泥中細(xì)菌多樣性及群落構(gòu)成，并采用多樣性指數(shù)H、優(yōu)勢(shì)度指數(shù)D、覆蓋度C及稀釋度曲線等對(duì)所建立的文庫(kù)進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果表明，該16S rRNA基因文庫(kù)多樣性指數(shù)H和優(yōu)勢(shì)度指數(shù)D分別為2.12和7.15，文庫(kù)覆蓋率為81.2%，稀釋度曲線減趨平緩，說(shuō)明該研究方法及研究結(jié)果不僅展示出池塘底泥中細(xì)菌菌群的豐富多樣，同時(shí)也能夠體現(xiàn)池塘底泥菌群的結(jié)構(gòu)類(lèi)型和組織水平。

程瑩寅[4]等研究發(fā)現(xiàn)主養(yǎng)草魚(yú)池塘底泥中主要的細(xì)菌類(lèi)群歸屬于7個(gè)細(xì)菌門(mén)類(lèi)：變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、放線菌門(mén)和浮霉菌門(mén)。該研究中主養(yǎng)草魚(yú)、混搭鯽魚(yú)的混養(yǎng)模式池塘底泥中細(xì)菌也包含了以上幾個(gè)類(lèi)群，在大的分類(lèi)上和程瑩寅等研究相同，但數(shù)量上差異較大，該研究中細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群是變形菌門(mén)（55%）和梭桿菌門(mén)（24%），且變形菌門(mén)占有絕對(duì)的數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)，盡管梭桿菌門(mén)在以前的報(bào)道中曾出現(xiàn)過(guò)，但很少作為主要優(yōu)勢(shì)類(lèi)群。通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，池塘底泥中Cetobacterium屬、Xanthomonas 屬和Sulfuritalea屬是其中的優(yōu)勢(shì)菌，所占比例為56.2%，目前還未見(jiàn)到池塘底泥中有這些屬的報(bào)道。NI Jiajia等[13]曾在淡水魚(yú)的消化道中分離到Cetobacterium somerae，能夠產(chǎn)生唯一含礦物質(zhì)的維生素B12調(diào)節(jié)魚(yú)類(lèi)新陳代謝，該菌存在于魚(yú)類(lèi)消化道可能是與池塘底泥中細(xì)菌相互影響的結(jié)果。黃單胞菌屬（Xanthomonas）[14]是專(zhuān)門(mén)寄生在植物上的，也可以是腐生的，能夠引發(fā)多種植物病害，目前雖尚未有對(duì)動(dòng)物尤其是魚(yú)類(lèi)危害的報(bào)道，但對(duì)養(yǎng)殖系統(tǒng)中水生植物存在著潛在威脅，同時(shí)該菌所產(chǎn)生的黃原膠卻可以廣泛應(yīng)用于食品、石油等工業(yè)。Hisaya Kojima[15]等曾在淡水湖中分離到Sulfuritalea屬，該菌是一種兼性自型微生物，營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單。

除以上優(yōu)勢(shì)菌外，筆者還分離得到Sterolibacterium、Caldilinea aerophila、Streptomyces aomiensis、Thermolithobacter ferrireducens、Prolixibacter、Planctomycetacia、Thiocapsa、Desulfomicrobium、Rhodocyclus和 Alkalitalea屬細(xì)菌，其中Prolixibacter屬菌具有較好的NaCl耐受性，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)要求比較低，同時(shí)還具有較強(qiáng)的降解BTEX類(lèi)污染物的能力[16]，能夠有效減少池塘受BTEX類(lèi)化合物的污染。在水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中，大量殘餌、養(yǎng)殖生物排泄物等沉到水底增加了底部有機(jī)物的含量，從而一方面造成水體中N、P元素的升高，在很大程度上加重了水體富營(yíng)養(yǎng)化，甚至造成水產(chǎn)養(yǎng)殖對(duì)于環(huán)境的污染；另一方面，也增加了硫化物的含量，硫化物對(duì)魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)危害較為嚴(yán)重，能夠降低機(jī)體中血液的攜氧能力，刺激、腐蝕魚(yú)類(lèi)的鰓組織。研究表明Sterolibacterium denitrificans是一種膽固醇降解菌，能夠降解養(yǎng)殖動(dòng)物死后固醇類(lèi)物質(zhì)的代謝；Rhodocyclus、Candidate和Planctomycetacia屬的菌群具有脫氮除磷的功能；Thiocapsa、Desulfomicrobium屬菌大多為厭氧菌，常存在于廢水池、含硫溫泉及湖泊等淡水環(huán)境中，具有降低水中硫化物的作用。因此它們?cè)陴B(yǎng)殖水體生態(tài)環(huán)境修復(fù)、改善水質(zhì)、提高水產(chǎn)養(yǎng)殖質(zhì)量方面發(fā)揮著重要作用。其他屬細(xì)菌也在參與水體中物質(zhì)代謝，能量流動(dòng)及微生物間相互作用發(fā)揮作用，例如Alkalitalea等具有纖維素降解功能等。

綜上所述，成都平原主養(yǎng)草魚(yú)、搭配鯽魚(yú)池塘底泥中細(xì)菌種類(lèi)很豐富，這些豐富的細(xì)菌可能執(zhí)行著很復(fù)雜的功能，

為水生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)循環(huán)與能量流動(dòng)做出了重大貢獻(xiàn)。同時(shí)，池塘底泥中也存在許多潛在的致病性和未知的細(xì)菌，池塘底泥微生物對(duì)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的影響及機(jī)理值得進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1]朱玉婷，楊學(xué)芬，王琴，等.主養(yǎng)草魚(yú)（Ctenopharyngodon idellus）池塘3種混養(yǎng)模式下氮含量的比較[J]. 生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學(xué)報(bào)， 2012， 28（3）：329-332.

[2] 楊芳， 高楊， 陳琴， 等. 淡水混養(yǎng)魚(yú)塘水質(zhì)對(duì)周?chē)h(huán)境的影響[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2013（4）： 146-148.

[3] 劉道玉， 吳偉. 水產(chǎn)養(yǎng)殖水體污染及微生物修復(fù)的研究[J]. 資源與環(huán)境科學(xué)， 2011（17）： 253-256.

[4] 程瑩寅， 吳山功， 鄭英珍. 等. 主養(yǎng)草魚(yú)池塘底泥微生物群落多樣性研究[J]. 淡水漁業(yè)， 2011， 41（6）： 43-49.

[5] 劉國(guó)才， 李德尚， 董雙林， 等. 對(duì)蝦綜合養(yǎng)殖生態(tài)系底泥細(xì)菌的數(shù)量動(dòng)態(tài)[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)， 2000， 11（1）： 138-140.

[6] 馬英， 錢(qián)魯閩， 王永勝. 對(duì)蝦養(yǎng)殖池沉積物細(xì)菌的遺傳多樣性[J]. 海南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版， 2009， 27（4）： 369-374.

[7] 蔡瑩， 李志江， 田蘊(yùn)， 等. 蝦池沉積物細(xì)菌多樣性分析和若干可培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)化探討[J].廈門(mén)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2010， 49（5）： 731-737.

[8] 范立民， 裘麗萍， 吳偉， 等. 養(yǎng)殖池塘底泥中一株脫氮菌的異常分離及鑒定[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2012， 28（29）： 152-156.

[9] 林亮， 李卓佳， 郭志勛， 等. 施用芽孢桿菌對(duì)蝦池底泥細(xì)菌群落的影響[J]. 生態(tài)學(xué)雜志， 2005，24（1）： 26-29.

[10] 向文良， 羅海， 梁華忠， 等. 基于16S23S rRNA ITS AFLP 對(duì)米酒發(fā)酵過(guò)程中原核微生物的演替分析[J]. 釀酒科技， 2010（2）： 43-46.

[11] TAMURA K， PETERSON D， PETERSON N， et al. MEGA5： Molecular Evolutionary Genetics Analysis Using Maximum Likelihood， Evolutionary Distance， and Maximum Parsimony Methods[J]. Molecular Biology and Evolution， 2011， 28（10）： 2731-2739.

[12] PEI ZH，EDMUND J B， YANG LY，et al. Bacterial biota in the human distal esophagus[J]. PNAS， 2004， 101（12）： 4250-4255.

[13] NI J J， YU Y H， ZHANG T L， et al. Comparison of intestinal bacterial communities in grass carp， Ctenopharyngodon idellus， from two different habitats[J]. Chinese Journal of Oceanology and Limnology， 2012， 30（5）： 757-765.

[14] MAJA LGNJATOV，MLLAN LVANOVIC ′ ，MILAN S ˇ EVIC ′ ，et al. Characterization of Xanthomonas euvesicatoria Strains Pathogens of Pepper in Serbia[J]. Pesticidii Fitomedicina， 2010， 25（2）： 275-284.

[15] HISAYA KOJIMA，MANABU FUKUI.Sulfuritalea hydrogenivoransgen. nov.， sp. nov.， a facultative autotroph isolated from a freshwater lake[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology， 2011，61：1651-1655.

[16] 張倩. 高鹽條件BTEX降解菌群多樣性、降解基因型及相容性溶質(zhì)分析[D]. 上海： 華東理工大學(xué)， 2012.