綿羊體表膿包病原的分離·鑒定及藥敏試驗(yàn)

摘要 [目的]對分離自湖北省大悟縣的患病山羊體表膿包中的致病菌進(jìn)行分析和鑒定，以確定膿包中細(xì)菌的分子分類學(xué)地位及藥物敏感性。[方法]通過對分離株16S rRNA基因序列分析，結(jié)合細(xì)菌菌落形態(tài)和細(xì)菌生化特性分析進(jìn)行細(xì)菌分離和鑒定，并對已鑒定的菌株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，篩選出膿包細(xì)菌敏感性藥物。[結(jié)果]從膿包分離的細(xì)菌分別為葡萄球菌屬、大腸埃希氏桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬以及綠膿桿菌；藥物敏感試驗(yàn)表明這些細(xì)菌對藥物的敏感性不同，其中對頭孢類、喹諾酮類、氨基糖苷類以及氯霉素等敏感。[結(jié)論]該研究可為該地區(qū)該病流行病學(xué)的研究與防治藥物的研發(fā)提供參考。

關(guān)鍵詞 山羊；膿包；16S rRNA；藥物敏感性；鑒定

中圖分類號 S827 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）17-05503-03

Abstract [Objective] Pathogens isolated from pustule of goat surface in Hubei Dawu were analyzed and identified to determine its molecular taxonomic status and drug sensitivity. [Method] Isolates were isolated and identified according to the gene sequence of 16S rRNA， combining with morphological and biochemical characteristics. Then drug susceptibility tests were made to screen sensitive drug strains. [Result] Pseudomonas sp.， Escherichia coli， Acinetobacter sp.， Lysinibacillus sp. were isolated from the pustules in terms of the identification results； And drug susceptibility tests showed that these bacterias are sensitivity to cephalosporins， quinolones， aminoglycosides， and chloramphenicol. [Conclusion] The study can provide some references for the drug development and epidemiologic study of this area.

Key words Goat； Pustule； 16S ribosomal RNA gene； Drug susceptibility； Identification

山羊體表膿包是由于細(xì)菌入侵家畜皮下而引發(fā)的嚴(yán)重炎癥反應(yīng)，局部可出現(xiàn)腫大、熱痛和某些功能性障礙，嚴(yán)重時(shí)細(xì)菌及其產(chǎn)生的毒素能夠進(jìn)入血液循環(huán)而引起毒血癥或敗血癥。膿汁是機(jī)體組織在發(fā)生炎癥的過程中產(chǎn)生的濃稠或稀薄的滲出物，其中滋生大量的細(xì)菌，這些細(xì)菌的大量繁殖可造成組織變性壞死，嚴(yán)重時(shí)可造成羊群的大量死亡。因此，對膿包內(nèi)滋生的病原菌的分離、鑒定以及藥物敏感性分析，可為該病的深入研究及藥物防控等提供一定的理論依據(jù)。多種細(xì)菌可引起家畜皮下膿包病，如葡萄球菌、大腸桿菌、巴氏桿菌等[1]。有些細(xì)菌通過外傷感染家畜；也有部分細(xì)菌本身是家畜體內(nèi)正常的棲息菌，但在環(huán)境發(fā)生劇烈變化時(shí)在誘導(dǎo)期會(huì)產(chǎn)生大量的毒素，從而對家畜機(jī)體造成損傷。例如，最早從牛膿汁中分離出的化膿隱秘桿菌（Arcanobacterium pyogenes），寄生于家畜皮下，常引起牛羊的化膿性感染，并能誘發(fā)多種并發(fā)癥的產(chǎn)生[2]。因此，深入研究家畜皮下滋生的細(xì)菌種類及其生化耐藥特性等對家畜膿包病的診斷、預(yù)防及治療有重要借鑒意義。根據(jù)傳統(tǒng)的《細(xì)菌鑒定手冊》進(jìn)行細(xì)菌的分離鑒定存在一定的缺陷（如生化反應(yīng)不典型），受外界因素影響而使菌株形態(tài)各異等都會(huì)造成鑒定結(jié)果的差異化。同時(shí)，對于一些生長緩慢的菌株，傳統(tǒng)的鑒定方法大大增加了鑒定時(shí)間和成本。近年來，分子鑒定方法被廣泛應(yīng)用到細(xì)菌的分類中，如16S rRNA 是原核微生物中一段相對保守的序列，大小約為1 540個(gè)核苷酸，是目前最常被用于細(xì)菌分類的核酸序列，故有細(xì)菌分類“金指標(biāo)”之稱，其可變區(qū)和保守區(qū)交替排列使這段序列為細(xì)菌鑒定或種間關(guān)系預(yù)測提供了快速鑒定的依據(jù)。筆者利用16S rRNA的保守區(qū)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，將測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中已提交的細(xì)菌16S rRNA序列進(jìn)行比對，并對鑒定分類后的菌株進(jìn)行常用藥物的的敏感性檢測，以尋找這些菌株的敏感性藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)樣本。從湖北省大悟縣3個(gè)養(yǎng)殖場隨機(jī)選擇患病山羊，無菌采集山羊體表未破裂膿包中膿汁6份，于4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要儀器。超凈臺（AIRTECR）；高壓蒸氣滅菌鍋（Systec）；恒溫培養(yǎng)箱（APLVS）；光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS25）；PCR儀（BioRad）；電泳儀（北京六一儀器廠）。

1.1.3 主要試劑。革蘭氏染色試劑盒，購自杭州微生物試劑公司；rTaq DNA聚合酶、dNTP、10×Loading buffer、DL2000 Marker，均購自大連寶生物工程有限公司；細(xì)菌擴(kuò)增的通用引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列為AF（上游引物）：5’AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3’；AR（下游引物）：5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’[3]。

營養(yǎng)培養(yǎng)基由蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉和瓊脂組成，pH為7.2。血平板培養(yǎng)基由蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、瓊脂、5%的新鮮去纖維羊全血組成。

藥敏紙片：青霉素類（氨芐青霉素、苯唑青霉素、優(yōu)立新）；喹諾酮類（洛美沙星、氧氟沙星）；頭孢類（頭孢羥氨芐、頭孢曲松）；氨基糖苷類（慶大霉素、卡那霉素）；多肽類（桿菌肽）；磺胺類（磺胺甲基異惡唑）；大環(huán)內(nèi)酯類（紅霉素、羅紅霉素）；糖肽類（萬古霉素）；呋喃類（呋喃妥因）；四環(huán)素類（四環(huán)素）；其他類（氯霉素、利福平、磷霉素）。以上藥片均購自北京賽為思生物技術(shù)開發(fā)中心。

1.2 方法

1.2.1 綿羊皮下膿汁細(xì)菌的分培養(yǎng)。將無菌采集的膿汁按照1 ∶100的比例稀釋于無菌的生理鹽水中，將其充分振蕩混勻后，分2組劃線接種于營養(yǎng)培養(yǎng)基和血平板培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔5 h觀察1次菌落形態(tài)及數(shù)目，根據(jù)其菌落表面特征，顏色差異，溶血狀態(tài)，初步判斷細(xì)菌種屬[4]。分別挑取進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢鑒定，進(jìn)行細(xì)菌單一種的分離和純培養(yǎng)。保存單一菌種并進(jìn)行分子鑒定。

1.2.2 16S rRNA基因相似性分析鑒定。以分離培養(yǎng)的4株細(xì)菌DNA為模版，利用細(xì)菌的16S rRNA基因的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min 10 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min結(jié)束。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析。將膠回收擴(kuò)增基因片段，連接至Teasy載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109（TaKaRa公司），由南京金斯瑞生物有限公司測序，將測序結(jié)果與NCBI已提交的序列進(jìn)行比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)學(xué)觀察

營養(yǎng)培養(yǎng)基及血平板培養(yǎng)基上生長的菌落形態(tài)基本相似，均為圓形，邊緣整齊光滑，半透明凸起，但存在菌落大小及溶血與否的差異。根據(jù)其形態(tài)的差異，從中挑取可疑的單菌落，進(jìn)行革蘭氏染色并用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察，共從3個(gè)膿汁樣本中分離出4種形態(tài)各異的細(xì)菌。

2.2 16S rRNA 測序分析

將4種分離菌進(jìn)行16S rRNA PCR擴(kuò)增，其擴(kuò)增片段大小為1 600 bp左右（圖1），與預(yù)期片段大小相符。將測序結(jié)果與NCBI網(wǎng)站上已提交的序列進(jìn)行BLAST 比對，結(jié)果見表1。

3 討論

葡萄球菌廣泛存在于動(dòng)物和人類皮膚及粘膜。當(dāng)外界環(huán)境發(fā)生變化時(shí)，容易造成皮下的化膿感染，從而造成動(dòng)物皮下膿包的產(chǎn)生[5]。大腸埃希氏菌屬及不動(dòng)桿菌屬在許多化膿性感染的病例中均被發(fā)現(xiàn)。筆者利用改良后的營養(yǎng)培養(yǎng)基對膿汁樣品進(jìn)行分離培養(yǎng)，根據(jù)其16S rRNA序列進(jìn)行鑒定，共分離鑒定出4個(gè)種屬的細(xì)菌，分別為大腸埃希氏、葡萄球菌屬、不動(dòng)桿菌屬以及賴氨酸芽孢桿菌屬。

造成細(xì)菌性感染的皮下膿腫的原因是多樣的（例如日常管理混亂、不注意環(huán)境衛(wèi)生的保護(hù)與處理、動(dòng)物遭受外傷或經(jīng)人為的非正規(guī)無菌操作等），從而使病原入侵、滋生，造成皮下膿腫。目前，針對細(xì)菌性感染膿包，以抗生素治療為主，因此合理選取抗生素的種類對避免該病的反復(fù)爆發(fā)具有重要意義。在藥物選擇方面，應(yīng)盡量選擇廣譜、價(jià)廉、易獲取、安全的藥物進(jìn)行治療，以減少耐藥菌株的產(chǎn)生。該研究結(jié)果表明4個(gè)細(xì)菌分離株對于藥物的敏感性不盡相同，對頭孢類、喹諾酮類、氨基糖苷類以及氯霉素等敏感，可以考慮用以上幾類藥物配制廉價(jià)高效的藥物對羊體表膿包進(jìn)行清洗、預(yù)防和治療。另外，合理安排這幾種抗生素的用量及療程，理論上可以起到較好的治療效果。

由于不同地理環(huán)境條件下可造成不同細(xì)菌滋生，因此筆者僅對綿羊體表膿包中的細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定及藥敏試驗(yàn)。為了理清這4種細(xì)菌的致病性研究，今后尚需要進(jìn)一步研究。另外，以16S rRNA基因?yàn)榛A(chǔ)建立的細(xì)菌鑒定方法也存在一定的缺陷，不同種或同種細(xì)菌之間可發(fā)生基因水平轉(zhuǎn)移（Horizontal gene transfer，HGT），并且與16S rRNA重組，形成嵌合體[6]，從而對基因分析的準(zhǔn)確性造成了一定的影響。16S rRNA基因是細(xì)菌的通用保守序列，這就對試驗(yàn)的操作過程提出了更高的要求。另外控制各環(huán)節(jié)無菌操作防止雜菌污染是鑒定結(jié)果準(zhǔn)確的基本要求。另外，根據(jù)序列的相似度進(jìn)行菌種鑒定，多少范圍內(nèi)判定細(xì)菌鑒定到科、屬或種的水平，微生物學(xué)者們尚未達(dá)到共識[7]。這些都需要進(jìn)一步研究和發(fā)展來彌補(bǔ)這些方面的不足。

筆者在有氧的環(huán)境中從山羊體表膿包中分離培養(yǎng)了4株病原菌，通過形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行了初步觀察與鑒定后，結(jié)合分子鑒定手段對其進(jìn)行了種屬分類，并通過藥物敏感性試驗(yàn)分析4個(gè)菌屬對16種常見藥物的抗藥作用，這些都為揭示山羊體表膿包的病原組成及防治措施提供了一定的參考。該研究是在有氧的環(huán)境條件下進(jìn)行的，而對膿包中厭氧菌的分類的組成未進(jìn)行深入研究，同時(shí)，筆者通過藥物敏感性試驗(yàn)篩選出部分對膿包分離株具有較好抑制作用的抗菌藥物，但僅限于實(shí)驗(yàn)室層面，尚未進(jìn)行臨床驗(yàn)證，因此還需要后續(xù)工作來完善和補(bǔ)充。

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