微生物脫色菌的篩選和對剛果紅脫色條件的研究

摘要 [目的] 從校園污水處理站污泥中篩選具有較強脫色能力的微生物，并且研究其脫色特性。[方法]將帶有染料的細菌培養(yǎng)基、真菌培養(yǎng)基進行篩選。[結果] 篩選得到一株脫色性能高的真菌，初步鑒定為霉菌屬。該試驗初步研究了該菌對剛果紅的脫色條件和脫色機制。該菌在28 ℃培養(yǎng)時脫色率高達97.3%。該真菌在剛果紅濃度≤60 mg/L時，脫色率達到95%以上。當剛果紅濃度高達105 mg/L時，脫色率仍達到58.6%。這說明該菌對剛果紅的耐受性較好。研究表明，該菌在酸性和中性環(huán)境中脫色效果更好，在pH≤7時脫色率均能達到95%以上；當脫色48 h時，該菌對剛果紅的脫色率就能達到95%以上。該菌株的脫色能力是以吸附為主，是在生長過程中將色素吸附包裹起來達到對染液的脫色效果。[結論] 該菌株對剛果紅具有較好的脫色效果。

關鍵詞 脫色率；剛果紅；脫色條件

中圖分類號 S182 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）17-05362-03

Abstract [Objective] Screening the microorganisms with strong decolorization capacity from the campus sewage treatment plant sludge， and study its decolorization characteristics. [Method] Using a dye medium to screen the bacteria and fungi. [Result] A fungal with high decolorization capacity was screened and was identified as Aspergillus. The decolorization conditions and discoloration mechanism of the strain to Congo red was studied. The strain get the highest decolorizing rate 97.3% when it was cultured at 28 ℃， when the concerntration of Congo red is less than 60 mg/L， the decolrization rate is higher than 95%， and the decolrization rate still reach 58.6% when concerntration of Congo red is 105 mg/L. This illustrated that the strain has good tolerance to Congo red. The study found that the strain has better decolrization rate when it’s in acidic and neutral environment. When pH ≤ 7， the decolorization rate can reach more than 95%， when the strain decolorize Congo red for 48 h， the decolorization rate can reach more than 95%. The decoloring method of the strain is primarily by adsoption， the stain adsorbs and wraps the dye during its growth progress. [Conclusion] The stain has good decolrization effect on the Congo red.

Key words Decolorization rate； Congo red； Decolorization conditions

染料是印染、紡織和造紙等工業(yè)廢水中的重要污染物之一。當前，生產(chǎn)所用的染料絕大部分為人工合成的化學染料。按其發(fā)色基團的結構，可以分為偶氮染料、蒽醌染料、三苯基甲烷等[1-2]。這些含有胺基的芳香族化合物結構穩(wěn)定，難降解，毒性較大，環(huán)境滯留期長。隨著染料廢水的排放，進入環(huán)境的染料數(shù)量和種類不斷增加，染料造成的環(huán)境污染日趨嚴重[3]。剛果紅是一種聯(lián)苯胺偶氮染料，是第一個用于棉制品直接染色的染料。剛果紅被廣泛用于紡織品、皮革制品等染色，但它在人體內(nèi)會產(chǎn)生聯(lián)苯胺，誘發(fā)膀胱癌[4]。

常用的處理印染廢水的方法有吸附脫色、混凝沉淀、化學氧化、離子交換及生物降解等。采用物化處理較有效，但是處理經(jīng)濟費用高，而且產(chǎn)生大量難處理的污泥，形成二次污染等問題[5-6]。而微生物法一般不會造成二次污染，處理成本低廉。印染廢水中大部分有機物由于具有可被生物降解、可回收目標物質(zhì)等優(yōu)點受到人們的重視。目前，已報道的具有脫色能力的微生物主要有細菌、酵母、絲狀真菌等。細菌對染料的脫色機理主要是在厭氧條件下可以產(chǎn)生偶氮還原酶，將偶氮類染料降解為苯胺類物質(zhì)。還原產(chǎn)物需在好氧菌作用下進一步分解，從而達到脫色作用。而真菌脫色機理可分吸附脫色和降解脫色[7-8]。筆者從污泥中篩選出高效的脫色微生物菌株，并且研究其脫色特性，為利用微生物法處理印染廢水提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

分離材料。取自校園污水處理站曝氣池、沉淀池和污泥池的活性污泥。

1.1.2

培養(yǎng)基。馬丁孟加拉紅培養(yǎng)基組成為：葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，孟加拉紅溶液3.3 ml，瓊脂15～20 g，濃度2%去氧膽酸鈉溶液20 ml，鏈霉素（10 000 U/ml ）3.3 ml，水1 000 ml，自然pH。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基組成為：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂15～20 g，水1 000 ml。霉菌液體培養(yǎng)基組成為：葡萄糖10 g，磷酸二氫鈉0.5 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸銨2 g，磷酸氫二鉀0.5 g，氯化鈣0.1 g，水1 000 ml。細菌選擇培養(yǎng)基組成為：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基含有終濃度為50 mg/L的剛果紅染料。剛果紅染液培養(yǎng)基組成為：霉菌液體培養(yǎng)基加入剛果紅染料。

1.2 方法

1.2.1

菌株的分離與篩選。

各稱取1 g污泥樣品，分別置于含100 ml無菌水的無菌三角瓶中，充分搖勻靜置20 min后，吸取1 ml上清液至裝有50 ml分離培養(yǎng)基的三角瓶中，于28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。取1 ml培養(yǎng)液稀釋到10-3、10-4、10-5后，各取0.2 ml稀釋液涂布在真菌培養(yǎng)基和細菌選擇培養(yǎng)基平板，分別置于28和37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。選擇生長較好的且菌落周圍有透明圈的菌株進行平板劃線純化。

1.2.2

脫色能力的測定。將平板劃線后的單菌落接種到裝有25 ml剛果紅染液培養(yǎng)基的 150 ml三角瓶中， 28 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結束后，測定培養(yǎng)基的脫色率，以未接種液體培養(yǎng)基作空白對照。

脫色率計算公式為：脫色率=（A-B） / A × 100%

式中，A為空白對照的染料液體培養(yǎng)基在500 nm的吸光值；B為脫色后染料液體培養(yǎng)基在500 nm的吸光值[9]。

1.2.3

脫色菌脫色條件研究。

1.2.3.1

剛果紅濃度的影響。分別配制濃度為15、30、45、60、75、90、105 mg/L的剛果紅染液培養(yǎng)基，115 ℃滅菌20 min后，按1%接種量取菌懸液加入到含有25 ml染液培養(yǎng)基的100 ml錐形瓶中，每個濃度梯度重復3次。搖勻后在28 ℃培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)一定時間后用分光光度計測定脫色后染液培養(yǎng)基的吸光度，以未接種的空白染色培養(yǎng)基做對照，計算脫色率。

1.2.3.2

脫色時間的影響。配制剛果紅濃度60 mg/L的染液培養(yǎng)基，按1%接種量接種菌懸液到含有125 ml染液培養(yǎng)基（用滅菌鍋115 ℃滅菌20 min）的500 ml錐形瓶中， 28 ℃培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)，從培養(yǎng)12 h后開始測定吸光值，然后每隔6 h取樣至培養(yǎng)54 h后結束，計算不同培養(yǎng)時間的脫色率。

1.2.3.3

溫度的影響。配制剛果紅濃度為60 mg/L的染液培養(yǎng)基，按1%接種量取菌懸液加入到含有25 ml染液培養(yǎng)基的100 ml錐形瓶中，分別在28、37 ℃的培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)48 h，測定各瓶培養(yǎng)基的吸光度，計算不同培養(yǎng)溫度下脫色率。

1.2.3.4

pH的影響。分別配制pH 3、4、5、6、7、8、9且剛果紅濃度均為60 mg/L的染液培養(yǎng)基，按1%的接種量接種，28 ℃的培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)48 h，測定錐形瓶中溶液的吸光度，計算不同培養(yǎng)pH條件下脫色率。

1.2.4

脫色方式的研究。第1組用培養(yǎng)12 h、長成極小菌絲球的菌懸液按1%的接種量分別接種剛果紅濃度為60 mg/L染液培養(yǎng)基和滅菌的剛果紅水溶液，測定培養(yǎng)48 h的脫色率；第2組將培養(yǎng)了48 h、明顯長成菌絲球的菌液按1%的接種量接種至剛果紅濃度為60 mg/L染液培養(yǎng)基和滅菌的剛果紅水溶液，測定培養(yǎng)48 h的脫色率。比較4種不同條件下的脫色率，初步研究該菌的脫色機理。

2 結果與分析

2.1 菌株的篩選

通過平板初篩和反復劃線分離以及搖瓶復篩，最后獲得一株脫色能力較強的真菌。通過菌落形態(tài)觀察和鏡檢分析，初步判斷為霉菌屬。

2.2 脫色菌脫色條件的研究

2.2.1

剛果紅濃度的影響。由圖1可知，菌株的脫色率在剛果紅濃度≤60 mg/L時高達95%以上。當剛果紅的濃度超過60 mg/L時，菌株的脫色率明顯下降。這說明染料濃度大于60 mg/L時，對菌體的脫色有明顯的抑制作用。這是因為高濃度的染料對菌體的毒害作用越明顯，而當染料濃度大于60 mg/L時，超過菌體的耐受能力，使得脫色率下降。即使如此，當剛果紅濃度高達105 mg/ml時，脫色率仍達到60%，說明該菌對剛果紅的耐受力和脫色能力較強。

2.2.2

脫色時間的影響。由圖2所知，隨著培養(yǎng)時間的延長，脫色率不斷提高，當培養(yǎng)時間達到48 h時，脫色率達到最高值（96.4%），隨后脫色率保持不變。不同真菌達到最大脫色率的時間也不同。張昊等[10]報道的2株真菌中Fusariun oxysporum 24 h能達到脫色率為96%，而Geosmithia viridis 36 h后的脫色率僅為82%。也有脫色真菌需要培養(yǎng)10 d，脫色率才達到最高（83.2%）[11]。接種量也是影響脫色時間的一個因素。有研究表明，較大的接種量能縮短脫色時間[12]。

2.3 脫色方式的研究

由圖5可知，接種至染液培養(yǎng)基中菌株最后的脫色率均高于接種至剛果紅水溶液中脫色率。這是由于染液培養(yǎng)基能給菌株提供營養(yǎng)物質(zhì)，有利于菌株的生長，從而有利于脫色。但是，接種前菌株的生長狀態(tài)也會影響脫色率。由圖6可知， 培養(yǎng)12 h后菌液接種至染液培養(yǎng)基后的脫色率最高，達到96.6%，遠高于48 h后菌絲球的脫色率。形成明顯的較大的菌絲球后，菌株的生長活性降低，即使提供足夠的營養(yǎng)，菌株生長緩慢，所以脫色率僅為20%左右，比接種至剛果紅水溶液的脫色率只高3%左右。這4組試驗說明，該菌株邊生長邊吸附，從而達到脫色效果。通過肉眼觀察，發(fā)現(xiàn)A組試驗最后獲得帶有剛果紅染料的菌絲球。已有文獻證實，大多數(shù)真菌通過吸附機制進行脫色[14]。吸附型的脫色菌比降解型的脫色菌更有優(yōu)勢。這是因為降解型脫色菌可能會產(chǎn)生新的有毒產(chǎn)物，造成二次污染，而吸附型脫色菌可以避免這樣的后果。所以，該研究獲得的菌株有更好的應用潛力。

3 討論

通過從校園污水處理站污泥中篩選得到一株對剛果紅有很好脫色效果的真菌，初步鑒定為霉菌屬。研究表明，該菌在28 ℃培養(yǎng)時脫色效果最好，脫色率高達97.3%。該真菌在剛果紅濃度≤60 mg/L時，脫色率可達到95%以上；當剛果紅濃度高達105 mg/L時，脫色率仍達到58.6%。這說明該菌對剛果紅有較好的耐受性。研究發(fā)現(xiàn)，該菌在酸性和中性環(huán)境中的脫色效果更好，在pH≤7時脫色率均能達到95%以上；該菌對剛果紅進行脫色處理48 h，脫色率就能達到95%以上。該菌株的脫色能力是以吸附為主，是在生長過程中吸附色素，從而達到對染料脫色的作用。該研究表明，該菌株對剛果紅具有較好的脫色效果。

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