阿維菌素類藥物酶聯(lián)免疫快速檢測(cè)試劑盒的制備及檢測(cè)效果

摘要：應(yīng)用酶聯(lián)免疫法，研制一種用于食品中阿維菌素類藥物的快速檢測(cè)試劑盒。利用該方法與高效液相色譜法檢測(cè)實(shí)際樣本對(duì)照，其陰、陽性判斷結(jié)果一致。試驗(yàn)證明檢測(cè)試劑盒具有較高的靈敏度及特異性，操作便捷、穩(wěn)定可靠，可作為食品中阿維菌素殘留快速檢測(cè)的一種簡(jiǎn)便方法。

關(guān)鍵詞：阿維菌素類藥物 酶聯(lián)免疫法 快速檢測(cè)

中圖分類號(hào)：S854文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-5336（2014）14-0019-04

Abstract： The method of enzyme-linked immune-sorbent assay （ELISA） was used to detect the residues of AVMs in food. The judgment of positive and negative were the same when using ELISA and HPLC to detect the samples. The ELISA method was sensitive with high repeatability and specificity， and suitable for detecting AVMs residues in food.

Key Words： AVMs enzyme-linked immune-sorbent assay（ELISA） quick-tested

食品行業(yè)是一個(gè)關(guān)系到人們健康的敏感行業(yè)，食品安全問題引起了全社會(huì)前所未有的關(guān)注。盡管科技進(jìn)步顯著降低了疾病對(duì)人類的危害，但隨著新型農(nóng)藥、獸藥的大量使用，農(nóng)、獸藥殘留仍然是人類健康的威脅之一。阿維菌素（Avermectins）是一種應(yīng)用廣泛使用的殺蟲、殺螨劑，是一種具有十六元環(huán)結(jié)構(gòu)的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。由于其具有高效、廣譜、低殘留、相對(duì)安全等特點(diǎn)，一直被廣泛用于農(nóng)藥和畜牧業(yè)中。目前，主要采用儀器檢測(cè)對(duì)農(nóng)畜牧產(chǎn)品中的阿維菌素藥物殘留進(jìn)行檢測(cè)控制，但儀器設(shè)備及試劑較昂貴、耗費(fèi)長(zhǎng)、需配備專業(yè)的檢測(cè)人員，不便于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，給檢測(cè)造成了很大的困難。

本研究在何方洋[1]已經(jīng)成功研制出阿維菌素抗原及單克隆抗體的基礎(chǔ)上，自制阿維菌素抗原和阿維菌素單克隆抗體，以酶標(biāo)記后采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒原理制作出快速檢測(cè)試劑盒，以滿足靈敏度高、成本低廉及檢測(cè)及時(shí)的篩查工作。

1 實(shí)驗(yàn)材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品購自北京標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；牛血清白蛋白（BSA）、氯化鈉、磷酸鹽等均購自北京百欣試劑公司；酶標(biāo)儀（最大量程為4.0）上海雷勃分析儀器有限公司；渦旋儀、均質(zhì)器湖南湘立科學(xué)儀器有限公司；牛血清白蛋白BSA、卵清蛋白OVASigma公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗美國(guó)Jackson公司；底物顯色液由A液和B液組成，A液為過氧化氫，B液為四甲基聯(lián)苯胺；2%氯化鈉溶液、洗滌液、封閉液、終止液；實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 AVM抗原的制備

AVM抗原的制備參照朱蓓蕾[2]等人的方法。

1.2.2 AVM單克隆抗體制備及鑒定

（1）動(dòng)物免疫方法。以AVM-BSA為免疫原，免疫雌性BALB/c小鼠（8～12周齡）。首次免疫每鼠用100g的AVM-BSA（以載體蛋白計(jì)）與等量FCA混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射。二免和三免時(shí)，將FCA換成FICA，劑量和方法同首免。每次免疫間隔2周。融合前3天每只小鼠腹腔注入50gAVM-BSA進(jìn)行加強(qiáng)免疫。

（2）免疫細(xì)胞培育。四免后第3天，無菌條件下取小鼠脾細(xì)胞與SP2/O細(xì)胞融合（10：1）。融合劑為50%的PEG2000，靜置2min，加入25ml無血清DMEM營(yíng)養(yǎng)液，靜置5min，8000g/min離心15分鐘，用20mlDMEM營(yíng)養(yǎng)液懸浮混勻，鋪種于2塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（含飼養(yǎng)細(xì)胞），每孔100l。待細(xì)胞長(zhǎng)至孔底的1/2～1/3時(shí)，陽性細(xì)胞迅速擴(kuò)大培養(yǎng)并采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆。10～14天后，取細(xì)胞上清檢測(cè)，計(jì)算陽性率。陽性率100%時(shí)，得到穩(wěn)定的細(xì)胞株。

（3）單克隆抗體制備。采用體內(nèi)誘生腹水法進(jìn)行大量單克隆抗體的制備，將BALB/C小鼠（8周齡）腹腔注入滅菌石蠟油0.5ml/只，7天后，再注入陽性細(xì)胞1×106個(gè)/只，10天后抽取腹水。離心去脂肪層和細(xì)胞層后，用飽和硫酸銨法純化，分裝凍存。陽性細(xì)胞經(jīng)過3次亞克隆，陽性率達(dá)100%，得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的細(xì)胞。

（4）單克隆抗體的鑒定。經(jīng)瓊脂擴(kuò)散沉淀試驗(yàn)、間接ELISA檢測(cè)、染色體計(jì)數(shù)和SDS-PAGE電泳檢測(cè)，確認(rèn)該單克隆抗體的免疫球蛋白亞類為IgG1，分子量為165.7KDa，染色體數(shù)目為89～94條，親和常數(shù)為1.80×1010M-1。

（5）羊抗鼠抗抗體及酶標(biāo)記抗抗體的制備。參照楊利國(guó)[3]等人的方法，以羊?yàn)槊庖邉?dòng)物，以鼠源抗體為免疫原免疫無病原體羊，得到羊抗鼠抗抗體；再采用過碘酸鈉法將羊抗鼠抗抗體與辣根過氧化物酶（HRP）進(jìn)行偶聯(lián)，得到酶標(biāo)記抗抗體。

1.2.3 試劑盒的制備

以100uL適宜稀釋倍數(shù)的阿維菌素抗原稀釋液包被96孔酶標(biāo)板，37℃孵育2h，然后用洗滌液洗板3次，拍干，用150uL封閉液封閉，37℃孵育2h，取板后拍干。

1.2.4 阿維菌素類藥物試劑盒配套試劑

96孔酶標(biāo)板，標(biāo)準(zhǔn)品1～6（濃度為0、0.5、1.5、4.5、13.5、40.5ug/L）高濃度標(biāo)準(zhǔn)品（濃度為5mg/L），酶標(biāo)二抗，抗體工作液（以最佳稀釋濃度稀釋的間克隆抗體），底物液A液，底物液B液，終止液，20×濃縮洗滌液，2×濃縮洗滌液。

1.2.5 樣本前處理方法

本研究以雞肉為樣本，用均質(zhì)器均質(zhì)組織樣本；稱取3.0±0.05g均質(zhì)后的組織樣本至50ml聚苯乙烯離心管中，加入9ml乙腈、3ml正己烷，用振蕩器3000g振蕩10min，15℃（59）離心5min；移取1ml下層液至10ml潔凈干燥玻璃試管中，于50-60℃水浴氮?dú)饬飨麓蹈桑患尤?ml復(fù)溶工作液，用渦旋儀渦動(dòng)1min，超聲波溶解10min，再用渦旋儀渦動(dòng)1min。取出100μl溶解后的樣本液，加入100μl復(fù)溶工作液，用渦旋儀渦動(dòng)30s，混勻；取20μl用于分析。

1.2.6 試劑盒各技術(shù)參數(shù)的確定

分別對(duì)試劑盒的靈敏度、準(zhǔn)確度、檢測(cè)限、精密度、穩(wěn)定性、交叉反應(yīng)率進(jìn)行試驗(yàn)，并將靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度與HPLC檢測(cè)的靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度進(jìn)行對(duì)比。

2 結(jié)果分析

2.1 最佳單克隆抗體濃度的確定

測(cè)定添加10μg/kg阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品的雞肉樣品OD450的結(jié)果見表1。

結(jié)果表明，抗體濃度為1×103時(shí)標(biāo)準(zhǔn)曲線扭曲變形相關(guān)參數(shù)無法計(jì)算，可以看出抗體濃度在4×104：1000倍稀釋時(shí)，最大吸光值、回收率和50%抑制濃度均處于最佳狀態(tài)。

2.2 最佳抗原包被濃度確定

由表中可見，隨著包被濃度的降低，曲線的IC50值也在下降（即靈敏度在提高），AVM-OVA包被抗原3000倍稀釋時(shí)，試劑盒IC50和最大吸光度值等技術(shù)指標(biāo)均較好，6000倍稀釋時(shí)試劑盒的吸光度值較低，因此選擇3000倍的AVM-OVA稀釋濃度進(jìn)行包被。

上述一系列實(shí)驗(yàn)表明，阿維菌素ELISA檢測(cè)方法的最適條件分別為：包被抗原液稀釋倍數(shù)為3000，單克隆抗體液稀釋倍數(shù)為40000，酶標(biāo)二抗液稀釋倍數(shù)為1000。

2.3 試劑盒靈敏度和檢測(cè)限試驗(yàn)

該方法對(duì)雞肉樣本的檢測(cè)限為1.5g/kg，對(duì)其它不同種類食品檢測(cè)限略有不同。具體結(jié)果見表3。

2.4 樣本精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)

以5、10、20mg/kg三個(gè)濃度的阿維菌素分別對(duì)雞肉樣品進(jìn)行添加，用三批試劑盒進(jìn)行測(cè)試（測(cè)試數(shù)據(jù)見表4）。

從表4可以得出，樣品平均回收率在68.5%～92.6%之間；批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15%。

2.5 試劑盒穩(wěn)定性試驗(yàn)

當(dāng)試劑盒存放在4℃時(shí)，經(jīng)過12個(gè)月的測(cè)定，從生產(chǎn)之日起到第9個(gè)月，試劑盒的最大吸光度值（零標(biāo)準(zhǔn)）、50%抑制濃度、阿維菌素添加回收率均在正常范圍之內(nèi)。到第12個(gè)月時(shí)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)吸光度值在0.6以下，試劑盒靈敏度有一定下降，陽性樣本加以率也有下降趨勢(shì)。

當(dāng)試劑盒存放在37℃時(shí)，該試劑盒在37℃經(jīng)7天的保存試驗(yàn)，OD值有所下降，但零標(biāo)準(zhǔn)吸光度值仍在0.9以上?；厥章试?3.4%-97.3%；標(biāo)準(zhǔn)品板內(nèi)變異系數(shù)在10%以下。將試劑盒在37℃保存的條件下放置7天，（據(jù)唐偉國(guó)著[4]《醫(yī)學(xué)驗(yàn)診斷試劑的制備與應(yīng)用》介紹，試劑盒在37℃每穩(wěn)定一天，可相當(dāng)于4～10℃保存一個(gè)半月）進(jìn)行老化試驗(yàn)，結(jié)果表明該試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全符合要求。

從以上研究可得出阿維菌素類藥物多殘留試劑盒可以在4℃至少保存6個(gè)月以上。

2.6 交叉反應(yīng)率試驗(yàn)

阿維菌素抗體與麥迪霉素、螺旋霉素、鏈霉素、慶大霉素、新霉素和四環(huán)素等非阿維菌素類藥物的交叉反應(yīng)率均小于1%，而與阿維菌素類藥物的交叉反應(yīng)率大，說明抗體特異性高。結(jié)果見表5。

2.7 與高效液相結(jié)果比較

2.7.1 靈敏度比較

用本試劑盒和儀器方法[6]分別測(cè)定了隨機(jī)雞肉樣品共10份樣品，結(jié)果如表6。

由于儀器方法的最低檢測(cè)限為1g/kg，低于1g/kg的樣品不能檢出；用試劑盒方法檢測(cè)雞肉樣品的最低檢測(cè)限為1.5g/kg，按照試劑盒最低檢測(cè)限1.5g/kg判定，低于1.5g/kg的，表示符號(hào)為“-”，高于1.5g/kg的，按照實(shí)際檢測(cè)結(jié)果報(bào)告。從表可知，試劑盒的準(zhǔn)確度與儀器檢測(cè)結(jié)果相同，陰陽性符合率為100%。

2.7.2 精密度和準(zhǔn)確度比較

同等條件下，分別按照高效液相色譜和自制試劑盒檢測(cè)提供的方法，以5g/kg濃度對(duì)空白雞肉進(jìn)行阿維菌素添加回收試驗(yàn)，比較儀器檢測(cè)方法和自制試劑盒檢測(cè)方法的平均回收率和變異系數(shù)。自制試劑盒檢測(cè)方法中，將添加樣品在3塊不同酶標(biāo)板上測(cè)定，做4個(gè)平行，計(jì)算變異系數(shù)。結(jié)果見表7。

由表7可見，高效液相色譜檢測(cè)方法以5g/kg濃度添加，平均回收率為82.0%，變異系數(shù)為7.0%。自制試劑盒以5g/kg濃度添加時(shí)，平均回收率在73.4%～78.0%之間，批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于15%，自研試劑盒適于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

3 討論

我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《動(dòng)物源食品中阿維菌素類藥物殘留量的測(cè)定》[5]和農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)《動(dòng)物源食品中阿維菌素類藥物殘留量的測(cè)定——高效液相色譜法》[6]，通過將樣品處理后，進(jìn)行衍生化后用液相色譜法進(jìn)行測(cè)定，該標(biāo)準(zhǔn)對(duì)動(dòng)物源食品中阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素、埃普利諾菌素的檢出限均是1.0μg/kg，而本研究中制備的試劑盒對(duì)應(yīng)雞肉、雞肝、蝦中阿維菌素的檢測(cè)限分別為1.5、1.9、1.6μg/kg，與國(guó)標(biāo)檢測(cè)限比較十分接近。另外，由于樣品衍生化需要一定的時(shí)間100min，再加上儀器檢測(cè)時(shí)間就更長(zhǎng)，因此利用酶聯(lián)免疫試劑盒能夠比國(guó)標(biāo)方法更加快速、簡(jiǎn)便地檢測(cè)出動(dòng)物源食品中的阿維菌素類藥物的含量，而該試劑盒的操作時(shí)間最長(zhǎng)僅需25min，適合現(xiàn)場(chǎng)大量檢測(cè)樣本的檢測(cè)，更符合快速檢測(cè)的要求，實(shí)現(xiàn)了對(duì)阿維菌素類殘留的簡(jiǎn)便、快速、精確檢測(cè)。

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