類風濕關節(jié)炎動物模型在中醫(yī)研究中的應用

孫佳蕾，武 平，陳白露，周玉梅，彭 麒，楊春華，楊 晏,胡偉峰

(成都中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，四川 成都 610000)

綜 述

類風濕關節(jié)炎動物模型在中醫(yī)研究中的應用

孫佳蕾，武 平，陳白露，周玉梅，彭 麒，楊春華，楊 晏,胡偉峰

(成都中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，四川 成都 610000)

類風濕關節(jié)炎；動物模型；中西醫(yī)結合病證

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性、炎性、系統(tǒng)性的自身免疫性疾病。臨床特征多表現(xiàn)為局部關節(jié)疼痛、功能障礙，伴有全身性輕、中度發(fā)熱等。目前確切病理機制不明。研究已證實，早期RA的診斷和治療可有效改善長期療效，同時減少或阻斷關節(jié)破壞的發(fā)展[1]。近年來一些比較成熟的RA動物模型相繼建立，為RA的實驗研究及臨床治療提供了基礎。由于臨床上RA病程及治療周期長，西藥治療往往不良反應大，因此具有安全無毒副作用的中醫(yī)針灸等療法在RA的臨床和實驗研究中被廣泛應用。本文對目前常用的RA模型及在中醫(yī)研究中常用的RA模型進行了探討，為進一步研究RA提供依據(jù)。

1 常用的RA動物模型

常用模型多為嚙齒類動物大/小鼠類，這類模型具有以下優(yōu)點：易獲取，體型相對較小、適合群養(yǎng)，價格低，可以減少研究投入；造模操作規(guī)程簡單成熟，方便重復實驗。其他動物模型如兔、猴、豬、狗，應用相對較少。目前被廣泛應用的、臨床特征和病理學與人RA相似的動物模型有佐劑性關節(jié)炎(adjuvant arthritis，AA)模型和Ⅱ型膠原誘導性關節(jié)炎(collagen induced arthritis，CIA)模型等。此類方法均造模簡單、成功率高，在臨床表現(xiàn)、實驗室指標和病理機制等方面與人RA非常接近。

1.1AA模型 AA又稱為弗氏佐劑關節(jié)炎，其模型是由細菌學家Freund于上世紀50年代建立，是免疫性關節(jié)炎動物模型的基本方法[2]，分為完全佐劑(FCA)和不完全佐劑(IFA)。弗氏佐劑方法是將液體石蠟與無水羊毛脂按2∶1或6∶4的比例配成1 mL混懸液，高壓滅菌，加入在800 ℃滅活1 h的減毒卡介苗或干燥結核菌10 mg制成。不加卡介苗的為不完全佐劑。造模多采用大鼠足跖部皮下注射法，一次注入0.1 mL。弗氏佐劑還可免疫其他如兔、羊等多種動物。

AA的發(fā)病原理主要是分子模擬理論[3]。結核桿菌的一個蛋白分子與關節(jié)滑膜上的一個糖蛋白分子結構相似，可以被同一株T細胞克隆所識別,從而誘發(fā)針對關節(jié)的免疫反應。AA模型的病理特征[2-4]主要表現(xiàn)為早期致炎部位的炎癥反應，多出現(xiàn)對側和前足腫脹，呈進行性加重，行動不便，耳和尾部出現(xiàn)關節(jié)炎小結，以及體質量下降等特征，這些表現(xiàn)接近人RA，并且致敏對側繼發(fā)性自身免疫性腫脹，提示AA大鼠與RA患者在關節(jié)腫脹方面具有相似性。用MRI檢測AA大鼠關節(jié)局部病理改變，發(fā)現(xiàn)繼發(fā)性對側足爪出現(xiàn)關節(jié)周圍炎癥；伴有骨質溶解性骨膜炎、骨膜新骨形成、單核細胞浸潤、血管翳形成，關節(jié)完全粘連等表現(xiàn)。

近年來，利用AA模型進行研究的報道眾多，如王偉東等[5]將雄性Wistar大鼠采用弗氏完全佐劑(FCA)造模，大鼠常規(guī)消毒后將其右后肢拉直，用1 mL注射器針頭于足跖中部皮內注射，每只大鼠注射0.1 mL FCA。18 d后模型建立，觀察動物活動情況及足踝腫脹情況。成功造模后，大鼠滑膜血管周圍出現(xiàn)大量血管內皮生長因子(VEGF)陽性細胞，呈強陽性重度表達，大鼠白細胞介素-6(IL-6)水平異常升高。并通過誘導滑膜的增生以及血管形成和成熟，最終促進血管翳的形成，從而增強炎癥的破壞作用。

另外，在對AA模型改進方面，佟麗等[6]采用礦物油直接與熱殺死分支結核桿菌(heat-killed mycobacterium tuberculosis,Mtb)混合,一次性經(jīng)尾根部皮下注射,誘導SD大鼠實驗性RA的發(fā)生。選用雄性SD大鼠(5～6周,體質量(160±20)g。準確稱取Mtb 40 mg,放入高壓消毒的研缽中,在無菌條件下,充分研磨，使Mtb的顏色由灰色變?yōu)榘咨?然后加入少量礦物油,使Mtb與礦物油充分混合,再研磨,最后加入礦物油使?jié)舛鹊竭_5 g/L,將該混懸液吸入特制玻璃注射器中,連接兩只注射器與三通管上,使Mtb-礦物油混懸液充分混合均勻。在SD大鼠尾根部經(jīng)皮下注射Mtb誘導劑(1 mg/只)成功造模。模型大鼠漸進出現(xiàn)皮膚、足趾部位紅、腫等炎癥信號,伴隨時間的延長,大鼠四肢嚴重腫脹,部分大鼠在尾部、耳部出現(xiàn)炎癥小結,后肢關節(jié)硬化、并逐漸喪失運動功能等現(xiàn)象。在SD大鼠被Mtb免疫后，外周血白細胞、血小板及單核細胞數(shù)明顯升高,細胞因子TNF-α、IL-1和IL-6水平明顯升高,T淋巴細胞亞群CD3+/CD4+的比值提高, 提示該模型與臨床表現(xiàn)的一致性。

總之，AA實驗動物模型的病變表現(xiàn)均與RA的臨床表現(xiàn)具有高度的相似性，且試驗動物易于選取，便于掌控與操作，造模方法簡單有效，在傳統(tǒng)的AA模型中,采用羊毛脂與液體石蠟配制的完全佐劑與卡介苗混合,在大鼠足趾部位注射誘導模型。而改良后的AA模型，采用礦物油直接與Mtb混合,操作方法則更為簡單，可進一步用于與RA相關的其他醫(yī)學研究中。

1.2CIA模型 CIA模型是由Trentham 于1977年首次報道。此后國內外利用該模型對RA的病因、發(fā)病機制、藥物篩選及免疫治療等方面進行了大量研究。Ⅱ型膠原大量存在于關節(jié)軟骨中，是一種與免疫系統(tǒng)隔絕的蛋白質，但在某些病理條件下可作為一種自身抗原呈現(xiàn)出來[7]。

CIA的制備如下：首先將一定量的Ⅱ型膠原溶于0.1 mol/L的乙酸，使?jié)舛葹? g/L，再與等體積的弗氏不完全佐劑或完全佐劑混合、乳化，制得Ⅱ型膠原乳劑，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｃ庖邥r，在動物背部、跖部、尾部多處進行皮內注射(0．5～2 mg/只)，免疫注射20 d左右時，用少量(0.5 mg/只)Ⅱ型膠原醋酸溶液腹腔內注射，作為激發(fā)注射加強免疫[8]，嚙齒類和靈長類動物均可發(fā)生CIA。動物首次免疫注射后，因局部炎癥刺激，可在皮內注射部位形成多處小的潰瘍灶，一般l周左右可自行結痂愈合。典型的關節(jié)炎體征在初次免疫后14～16 d出現(xiàn)，18～24 d(平均21 d)病變最為嚴重。往往是動物的一側后肢先出現(xiàn)典型的紅腫現(xiàn)象，隨之其余肢體也相繼受累。一般前爪炎癥發(fā)生率低，與前爪相比，后肢關節(jié)更易且更嚴重地受累。腫脹一般持續(xù)5～8周，最終可導致關節(jié)畸形。

石磊等[9]應用CIA模型進行研究，選擇雌性大鼠，采用天然牛Ⅱ型膠原與完全弗氏佐劑(CFA)混合成功制備Ⅱ型膠原CIA模型。大鼠主要表現(xiàn)為體質量減輕、精神萎靡、攝食及其他活動減少，帶有“病態(tài)”，伴輕微脫毛等。關節(jié)癥狀一般自后足首發(fā)，逐漸蔓延至前足，癥狀呈進行性加重。且外周血炎性細胞因子腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平明顯升高，顯示CIA模型是一種免疫性炎癥。組織病理學和X射線攝片結果顯示，關節(jié)軟骨組織、骨組織和滑膜組織呈典型的關節(jié)炎病變。其病理特征和人類RA極為相似。

韓冰等[10]選用雌性大鼠，使用Ⅱ型膠原(CⅡ)和IFA混合注射，不同時間點觀察實驗組大鼠及對其踝關節(jié)標本進行組織病理學研究。觀察到大鼠足關節(jié)發(fā)病時，足踝部皮膚發(fā)亮、充血，關節(jié)活動受限。關節(jié)組織病理學檢查可以觀察到滑膜增厚，炎性細胞浸潤，軟骨細胞變性壞死，表面凸凹不平。該研究表明，Ⅱ型異種蛋白與IFA可以誘導產生RA，所獲得的動物模型在病理、組織學、免疫學特征上與人的RA非常相似，是非常好的研究RA替代模型。龐學豐等[11]應用CIA模型，從細胞凋亡的角度，探討RA的治療作用機制。

綜上可知，CIA模型的病理學和免疫學特點以及發(fā)病機制等方面均與人類RA更相似，對CIA的深入研究將有助于對RA發(fā)病機制的進一步認識，為研究人類RA機制及治療等方面提供了有價值的實驗工具。

1.3人鼠嵌合模型 RA動物模型對藥物的反應與RA患者的療效并不完全一致。其中種屬差異是一個重要因素。而SCID小鼠由于其自然免疫特性，可用于建立人鼠嵌合模型。用于研究發(fā)病機制，特別是用于研究新藥的療效和機制。近年研究發(fā)現(xiàn)，RA滑膜植入SCID小鼠背部后能維持其特征12周以上，可作為人源化RA模型[12]。Matsuno等[13]報道將胎兒胸腺或胎肝、胎骨、腫瘤組織甚至成人的外周血造血干細胞移植到SCID小鼠體內，分別構建成幾種人鼠嵌合小鼠模型獲得成功。史戰(zhàn)國等[14]采用小鼠，無菌獲得12例非關節(jié)炎患者正常關節(jié)軟骨，修剪成約2 mm×2 mm×1 mm后備用；同時取10例RA患者(膝關節(jié)或髖關節(jié))滑膜組織修剪成約3 mm×6 mm的小塊(片)，這些小塊包裹軟骨后共植入SCID鼠腎包囊處，4例骨關節(jié)炎(0A)患者滑膜及2例正?；ね瑯犹幚碜鳛閷φ铡牡?周開始分批處死SCID小鼠并切除移植物，進行蘇木素-伊紅(HE)染色病理分析。結果大部分滑膜及軟骨在SCID小鼠體內存活，4周開始滑膜黏附并侵蝕軟骨，12周后RA滑膜明顯破壞軟骨，移植物細胞浸潤、軟骨破壞與RA病理類似，OA滑膜輕微破壞軟骨，而正?；缀醪黄茐能浌?，說明RA滑膜植入SCID可成活并能侵蝕軟骨。黃世峰等[15]將小鼠小鼠背部皮下植入的正常軟骨組織，隨后將RA滑膜和骨關節(jié)炎滑膜植入軟骨之上。成功造模10周后麻醉下處死小鼠，用放射免疫法檢測血清TNF-α含量，移植物進行組織病理學觀察。結果顯示RA滑膜組鼠血清中TNF-α放射含量明顯高于骨關節(jié)炎組(P<0.001)。組織學觀察顯示，RA組滑膜增生、軟骨侵蝕和軟骨降解積分均高于骨關節(jié)炎組(P<0.05)。顯示在SCID小鼠體內可成功建立RA動物模型。左芳芳等[16]將人RA滑膜組織或滑膜細胞聯(lián)合正常軟骨通過不同方式移入SCID小鼠體內，同樣成功獲得人源化RA動物模型，并深入探討了RA的發(fā)病機制。

綜上，RA-SCID小鼠作為人源化滑膜侵蝕軟骨模型，未來在探討機制特別是軟骨破壞及治療方面可能有明顯優(yōu)勢。由于倫理、法律等諸方面的制約，在人體內的RA試驗受到極嚴格限制，而動物模型與人的種屬差異是研究中一個重要影響因素。在滑膜、軟骨的選擇以及移植流程等方面進一步規(guī)范研究，以期建立一個穩(wěn)定可靠、方便可行的RA-SCID小鼠模型，為今后RA機制等方面的研究提供幫助。

除以上模型外，常用的RA動物模型還有卵蛋白誘導的關節(jié)炎模型、蛋白多糖誘導的關節(jié)炎模型、軟骨低聚體基質蛋白誘導的關節(jié)炎模型、降植烷誘導的關節(jié)炎模型、Avridine誘導的關節(jié)炎模型、鏈球菌細胞壁成分誘導關節(jié)炎模型、佐劑角叉菜膠誘導的關節(jié)炎模型等[17]。一般都用于特定的研究中，比如Avridine誘導的關節(jié)炎模型側重于研究輔劑和先天免疫系統(tǒng)在侵蝕性關節(jié)中的作用；佐劑角叉菜膠誘導的關節(jié)炎動物模型主要用于炎性藥物的篩選等方面。

2 中醫(yī)研究中的RA動物模型

在祖國醫(yī)學中，RA被稱為“痹證”“歷節(jié)”或“鶴膝風”。古典醫(yī)籍中很早就有對其病因的探討，例如《索問·評熱病論》曰：“邪之所湊，其氣必虛。”《素問·八正神明論》述：“以身之虛而逢天之虛，兩虛相感，其氣至骨，人則傷五臟。”再如《素問·痹論》記載：“風寒濕三氣雜至，合而為痹也?！薄端貑枴つ嬲{論》道：“腎者水也，而生于骨，腎不生則髓不能滿，主寒甚至骨也……病名為骨痹，是人當攣節(jié)也”。認為痹證的總體病因是人體正氣虛而易感六淫。而在治療上，孫思邈《千金方》記載：“歷節(jié)風痛，但痛處灸二七壯，佳?！薄夺t(yī)學綱目》中敘述：“白虎歷節(jié)風痛，取兩踝尖灸之?！迸R床上西醫(yī)西藥等方法因為治療周期久，藥物不良反應大，患者常難以堅持治療。而針灸、中藥等方法因為安全無害的特點更易于被患者接受。近年來關于中醫(yī)針灸治療RA作用機制方面的研究日益增多，為臨床治療RA提供了大量的實驗依據(jù)。常用的模型有以下幾種。

2.1病證結合的動物模型 中醫(yī)講究病證結合，“病”是對某疾病全過程的特點與規(guī)律所做的概括，是對該疾病的認識；“證”是對疾病過程中所處一定階段的病位、病因、病性及病勢等所作的概括，是對疾病當前本質所作的現(xiàn)象。為了使動物模型更能體現(xiàn)中醫(yī)學“證”的特色，近年來許多學者在弗氏佐劑動物模型的基礎上，結合中醫(yī)證的造模方法，創(chuàng)建了病證結合的RA動物模型。高慧琴等[18]選用健康雄性大鼠，風寒濕痹造模方法：首先，建立佐劑性關節(jié)炎大鼠模型，并將大鼠置于5～7 ℃冷水中，水深2 cm，伴以3檔風力，每日1次，每次20 min，連續(xù)14 d后成功造模大鼠風寒濕痹證模型。風濕熱痹造模方法類似：在建立佐劑性關節(jié)炎大鼠模型后，將大鼠置于36～38 ℃熱水中，水深2 cm，伴以3檔風力，同時給予37 ℃水浴恒溫熱蒸氣熏蒸，每日1次，每次20 min，連續(xù)14 d,造成大鼠風濕熱痹證模型。姜輝等[19]選用動物SD雄性大鼠，在建立佐劑性關節(jié)炎大鼠模型的第1天，將大鼠置于5～7 ℃冷水中，水深2 cm，站立其中20 min，同時伴以4級風力，每天1次，連續(xù)14 d。實驗結果表明，模型組大鼠繼發(fā)性足趾腫脹水平、多發(fā)性關節(jié)炎指數(shù)明顯升高，滑膜組織充血，滑膜細胞排列不規(guī)則，見大量炎性細胞浸潤，形成血管翳，提示大鼠風寒濕痹證模型制作成功。

中醫(yī)理論中，痹證與人體正氣虧虛關系密切，腎為先天之本，腎虛則易感外邪，合而為痹。因此腎虛痹證模型的研究具有重要意義。腎虛痹證模型是根據(jù)腎虛與性激素之間的關系建立起來的。造模方法如[20]：雌鼠，以二戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，碘酊、乙醇消毒，背部切口，摘除雙側卵巢，術后經(jīng)青霉素預防感染。3 d后再按照CIA造模方法進行造模。雄鼠，于CⅡ免疫注射后第2天起，每日灌胃1次，給予己烯雌酚0.5 mL(10 mg/mL)。結果發(fā)現(xiàn)與單純CIA對照，卵巢切除所致腎虛狀態(tài)的CIA發(fā)病率及嚴重程度均較單純CIA高而且重，說明雌激素水平低下在雌鼠CIA中起到了腎虛所應有的促進、加重病理過程的作用。

王燕等[21]選用無特殊病原體級Sprague-Daw ley大鼠，采用去勢法和羥基脲法制作腎虛動物模型,然后采用尾根部皮下注射Ⅱ型膠原與不完全弗氏佐劑混合物的方法誘導出關節(jié)炎。取適量牛Ⅱ型膠原溶液(濃度為2 g/L) 逐滴加入至等容積的不完全弗氏佐劑中，牛Ⅱ型膠原終濃度為1 g/L；冰浴中用勻漿器充分乳化，以滴入水中不擴散為度；取乳化后的混合物，按0.2 mL/只，于尾根部皮下注射；7 d后按0.1 mL/只，于尾根部皮下加強免疫1次。去勢CIA組：按常規(guī)方法做去勢手術，即摘除雙側卵巢與睪丸；術后28 d，再按上述方法進行CIA模型復制。羥基脲CIA組：大鼠給予羥基脲375 mg/(kg·d)灌胃,灌胃17 d后，按上述方法進行CIA 模型復制。結果顯示,去勢CIA組和羥基脲CIA組大鼠關節(jié)腫脹度明顯升高，去勢法制作的腎虛CIA大鼠IL-6、IL-10 及IFN-C水平明顯升高。說明用去勢法和羥基脲法制作的腎虛證RA動物模型, 既有明顯的腎虛癥狀,又有明顯的RA特征,說明這2種腎虛型RA病證結合模型能夠部分反映腎虛證RA患者的發(fā)病特點,具有可行性。

中醫(yī)針灸療法在預防RA的發(fā)生、降低復發(fā)、鎮(zhèn)痛消腫、提高生存質量、降低致畸和致殘率等方面有著很大優(yōu)勢。探討RA的中醫(yī)病機特點,有利于臨床上審證求因、治病求本，從而進一步提高辨證的準確性和臨床治療效果。病證結合模型與中醫(yī)理論結合較密切，有利于中醫(yī)藥治療RA的實驗研究，但此類模型仍存在相應問題，證是外邪與人體相結合的產物，同一邪氣作用于不同體質的人，證型未必一樣。另外，動物依從性差，四診信息獲取困難不確定。同時此類模型尚不完善，如環(huán)境刺激條件上沒有統(tǒng)一的標準，證候屬性評價困難；模型穩(wěn)定性、可靠性差等問題。對于中醫(yī)病癥結合模型仍需加強研究，可進一步規(guī)范各種證型產生的條件，并通過實驗研究進行驗證。

2.2常用的RA動物模型 中醫(yī)針灸在RA治療中具有獨特的優(yōu)勢，安全有效。因此，探討針灸對RA的作用機制無疑對RA的臨床治療具有重大意義，各類研究中，RA動物模型應用廣泛。劉明雪等[22]以佐劑性關節(jié)炎作為小鼠RA疾病模型進行研究，結果說明艾灸、針刺均可使佐劑性關節(jié)炎大鼠血清TNF-α水平明顯下降，且艾灸治療更為顯著。艾灸、針刺均可使佐劑性關節(jié)炎大鼠血清IFN-γ水平明顯升高，同樣艾灸治療更為顯著。胡玲等[23]為探討艾灸治療RA效應的作用機制，復制RA大鼠模型,觀察艾灸“腎俞”“足三里”穴對RA大鼠細胞因子IL-1D、IL-2的影響。結果顯示艾灸組能下調RA大鼠血清中IL-1β、IL-2含量，能顯著改善RA大鼠的足跖腫脹。在降低促炎癥細胞因子IL—1β、IL-2含量方面艾灸有顯著療效。此外彭傳玉等[24]成功獲得大鼠AA模型后觀察艾灸對RA大鼠的治療作用及其機制。結果說明艾灸治療能顯著改善大鼠RA癥狀，調節(jié)關節(jié)滑膜中Fas/FasL蛋白的表達，誘導滑膜細胞凋亡，提示這可能是艾灸發(fā)揮溫通作用的有效機制之一。周峰等[25]以弗氏完全佐劑成功造模。艾灸組以艾條灸大鼠“足三里”“腎俞”連續(xù)治療。結論提示艾灸可降低RA大鼠血清中細胞間黏附分子-1(ICAM-1)的含量，減少其在滑膜組織中的表達，從而抑制炎性細胞的浸潤、黏附、跨內皮移動，使滑膜炎癥逐漸好轉，關節(jié)腫脹、關節(jié)僵硬等癥狀得到緩解。

綜上所述，針灸療法對RA動物模型的作用機制較清楚，療效顯著。研究結果應用于臨床，既能利用中醫(yī)針灸治療RA簡便廉效，安全無害，無毒副作用，且具有整體調節(jié)作用的特點，又能針對RA臨床上病程久、治療難度高、西醫(yī)治療不良反應大、藥物依賴性強、價格昂貴等現(xiàn)象，充分體現(xiàn)中醫(yī)針灸治療RA的優(yōu)勢。

3 問題及展望

在RA的研究中，由于物種的差異性，目前尚沒有一種模型可以完全模擬人類RA的發(fā)病過程和特點。RA動物造模所選用的大多是小鼠或大鼠等嚙齒類動物，同人類的種屬差異是顯而易見的。而且在造模方法及路徑選擇上缺乏統(tǒng)一規(guī)范。因此，如何對于現(xiàn)階段使用最為廣泛的AA、CIA等模型，在實驗動物的種類、佐劑及其制備、用量、用法、造模路徑、評價指標等方面，總結出更為具體的造模標準流程，將進一步增強研究的科學性。

其次，實驗研究的目的是更好地提高臨床的療效。但是動物模型與人體之間存在差異，RA動物模型研究多采用單一性別方式或雌雄各半方式，而臨床RA女性患者較男性多見。因此，如何針對RA疾病不同臨床表現(xiàn)特點，采用相應的動物模型進行研究，將RA動物實驗研究與臨床研究有效結合，縮小動物研究與臨床研究之間的差異，是今后需進一步思考解決的問題。

總之，在對RA的研究中，如何充分利用RA動物模型現(xiàn)有的研究成果，探討中醫(yī)針灸治療的RA的優(yōu)勢和作用機制，將為臨床RA的診療提供更確切依據(jù)。

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國家自然科學基金資助項目(81373738)

武平，E-mail:wuping_33@163.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.04.041

R-332

A

1008-8849(2015)04-0444-04

2014-06-15