碳化二亞胺/羥基丁二酰亞胺交聯(lián)改性膠原蛋白纖維制備及其性能

岳程飛, 丁長坤, 李 璐, 程博聞

(天津工業(yè)大學 天津市先進纖維與儲能技術(shù)重點實驗室， 天津 300387)

膠原蛋白是主要的細胞外基質(zhì)分子[1-2]，其自身可自組裝成具有橫條紋的原纖維，為細胞生長提供支持，并負責結(jié)締組織的力學彈性[3-4]。在低溫環(huán)境下提取的膠原，仍可保持膠原特有的3股螺旋結(jié)構(gòu)，制備的材料也具有較好的柔韌性、低免疫原性、生物相容性與可降解性[5]；但天然膠原蛋白本身也存在很多缺陷，如力學性能差，耐水溶性差，不經(jīng)改性處理很難達到使用要求[6]，因此，通常需要對制備的膠原材料進行改性處理[7]，以提高其實際使用性能。

物理交聯(lián)和化學交聯(lián)是膠原蛋白主要的交聯(lián)改性方法[8]。膠原的物理交聯(lián)主要是通過紫外線照射、重度脫水以及熱處理等方法，在膠原分子間產(chǎn)生交聯(lián)，從而改善膠原的物理性能[9-11]。物理交聯(lián)雖然交聯(lián)度普遍偏低，但在交聯(lián)過程中一般不會引入外源性物質(zhì)，也不會產(chǎn)生不利于生物體的物質(zhì)。膠原的化學交聯(lián)主要是通過化學交聯(lián)劑在膠原分子的精氨酸、羥賴氨酸、組氨酸以及賴氨酸等殘基之間生成新的化學鍵，從而達到較高的交聯(lián)度[7，12]。常見的化學交聯(lián)劑主要有戊二醛[13]、碳化二亞胺[14]、京尼平[15]等，不同的交聯(lián)劑在交聯(lián)反應中會產(chǎn)生不同的物質(zhì)。

碳化二亞胺是一種化學性質(zhì)活潑的交聯(lián)劑，特別是1-乙基-3-(3-二甲基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)作為交聯(lián)劑時，會在相鄰膠原分子之間形成異構(gòu)肽鍵。同時，EDC不會滯留在膠原分子內(nèi)，而是通過交聯(lián)過程中的一系列化學反應轉(zhuǎn)化成一種細胞毒性極低的水溶性脲衍生物。這使得整個交聯(lián)過程既不會引入明顯的細胞毒性，又有較好的交聯(lián)效果[14，16]。目前，最常用的碳化二亞胺交聯(lián)劑是將EDC和N-羥基丁二酰亞胺(NHS)按一定比例配合使用，從而達到較高的交聯(lián)度。本文將牛肌腱膠原蛋白與一定比例的EDC/NHS充分混合后，在一定條件下進行濕法紡絲，得到經(jīng)過原位交聯(lián)的膠原蛋白纖維，比較了原位交聯(lián)與交聯(lián)浴交聯(lián)膠原蛋白纖維的性能差異。

1 實驗部分

1.1 原料與試劑

牛肌腱膠原蛋白，天津市賽寧生物工程技術(shù)有限公司；1-乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基丁二酰亞胺(NHS)，分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；冰乙酸、丙酮、氨水，分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 實驗儀器

濕法紡絲裝置，實驗室自制；DW-I型無級調(diào)速攪拌器，鞏義市予華儀器有限責任公司；TGL-16M型高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司；LLY-06型電子單纖維強力儀，萊州電子儀器有限公司；DSA100 M型單纖維接觸角測量儀，德國克呂士公司；S4800型場發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本日立公司；D/MAX-2500型X射線衍射儀，日本理學公司；TENSOR 37型傅里葉變換紅外光譜儀，德國布魯克科技有限公司；STA449F3型熱重分析儀，德國耐馳公司。

1.3 膠原蛋白纖維的制備

純膠原蛋白纖維的制備：使用濃度為0.5 mol/L的冰乙酸溶液溶解一定量的牛肌腱膠原，配制成質(zhì)量分數(shù)為1.5%的膠原紡絲液。為防止膠原在溶解過程中發(fā)生熱變性，整個機械攪拌過程維持在4 ℃左右。待膠原完全溶解后，在4 ℃條件下冷凍離心脫泡得到膠原紡絲液。注射泵擠出速度為0.5 mL/min，將紡絲液在凝固浴(成分為丙酮、氨水和去離子水，體積比為60.0∶1.0∶0.2)中靜態(tài)凝固3 min后得到凝膠態(tài)膠原初生纖維，再將膠原初生纖維在室溫條件下加5 g砝碼懸掛拉伸，自然風干得到純膠原蛋白纖維。

原位交聯(lián)膠原蛋白纖維的制備：使用濃度為0.5 mol/L的冰乙酸溶液溶解質(zhì)量比為3∶1的EDC和NHS，然后加入牛肌腱膠原，在溫度約為4 ℃時使用機械攪拌充分攪拌一定時間得到原位交聯(lián)膠原紡絲液，然后采用上述純膠原蛋白纖維制備工藝制備原位交聯(lián)膠原蛋白纖維。為防止紡絲液凝固，膠原溶解后須及時完成紡絲過程。

交聯(lián)浴交聯(lián)純膠原蛋白纖維的制備：在無水乙醇中加入質(zhì)量比為3∶1的EDC和NHS，然后加入少量氨水調(diào)節(jié)pH值為8，得到交聯(lián)浴。將純膠原蛋白纖維浸沒于交聯(lián)浴中交聯(lián)一段時間，然后在移出交聯(lián)浴的膠原蛋白纖維上懸掛5 g的砝碼牽伸，自然風干得到交聯(lián)浴交聯(lián)膠原蛋白纖維。交聯(lián)時間和交聯(lián)浴的濃度均采用原位交聯(lián)的最佳交聯(lián)時間和最佳濃度。

1.4 結(jié)構(gòu)表征與性能表征

1.4.1 力學性能測試

使用電子單纖維強力儀測試纖維的力學性能，夾距為10 mm，拉伸速率為10 mm/min，溫度為25 ℃，相對濕度為75%。

1.4.2 纖維形貌觀察

使用場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察纖維的表面與截面形貌。測試前對纖維進行干燥、噴金處理，加速電壓為10 kV。

1.4.3 結(jié)晶性能測試

使用X射線衍射儀對真空干燥后的纖維進行結(jié)晶結(jié)構(gòu)分析，采用Cu/Kα為輻射源，掃描速度為5(°)/min，掃描范圍為5°～40°。

1.4.4 化學結(jié)構(gòu)表征

使用傅里葉變換紅外光譜儀表征纖維的化學結(jié)構(gòu)，測試波數(shù)范圍為4 000～400 cm-1。

1.4.5 熱穩(wěn)定性測試

使用熱重分析儀測試纖維的熱穩(wěn)定性。測試時在氮氣保護環(huán)境下以10 ℃/min的升溫速率從25 ℃加熱到800 ℃，得到樣品的熱重(TG)曲線。

1.4.6 接觸角和耐水溶性測試

使用單纖維接觸角測量儀測試纖維的水接觸角。通過自動加液裝置在纖維上滴加定量液滴后分別測量0、60 s時的水接觸角。在室溫條件下，將定量的膠原蛋白纖維浸于蒸餾水中，60 s后將其取出置于濾紙上以除去纖維表面殘余的水，再置于天平中稱取質(zhì)量，可得到其吸水率，多次測量，取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 EDC/NHS交聯(lián)機制

EDC/NHS的交聯(lián)機制如圖1所示。EDC可促使膠原分子間發(fā)生交聯(lián)反應，其自身不與膠原的活性基團反應，而是通過激活膠原分子結(jié)構(gòu)中天冬氨酸和谷氨酸殘基上的羧基進行偶合反應，形成一種不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物O-異?；褰Y(jié)構(gòu)[14]。這種中間產(chǎn)物在氨基的攻擊下，可在膠原分子內(nèi)與相鄰膠原分子間形成酰胺鍵，從而完成分子內(nèi)和分子間的酰胺交聯(lián)。NHS作為親核試劑引發(fā)交聯(lián)反應的進行，增強中間產(chǎn)物O-異?；褰Y(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。EDC、NHS在交聯(lián)過程中不會成為膠原分子間的一部分，也不會進入膠原基質(zhì)中，而是轉(zhuǎn)化為一種具有水溶性的脲衍生物，該衍生物可被清洗掉，不會對細胞產(chǎn)生毒性[16]，因此，EDC/NHS是一種極為綠色環(huán)保的交聯(lián)劑。

圖1 EDC/NHS交聯(lián)機制Fig.1 Crosslinking mechanism of EDC/NHS

2.2 原位交聯(lián)膠原蛋白纖維性能分析

2.2.1 原位交聯(lián)工藝參數(shù)的優(yōu)化

本文所制備的膠原蛋白纖維主要應用于可吸收手術(shù)縫合線，這對纖維的柔軟性、打結(jié)性以及持結(jié)性都有較高的要求。由膠原制備的縫合線成纖性能好，且經(jīng)適當交聯(lián)處理可具有較好的耐水、耐熱性和優(yōu)異的力學性能。在EDC/NHS原位交聯(lián)膠原蛋白纖維的制備過程中，由于是將交聯(lián)劑與膠原直接共混，所以一旦交聯(lián)時間過長(或交聯(lián)劑過多)，膠原有可能在紡絲前出現(xiàn)凝膠化，將直接導致其難以紡制成絲；因而原位交聯(lián)時間與交聯(lián)劑用量對纖維紡制和力學性能的影響尤為顯著。

采用1.3節(jié)中原位交聯(lián)膠原蛋白纖維的制備方法，使用機械攪拌分別攪拌8、9、10、11、12、13 h，進行紡絲制備得到不同原位交聯(lián)時間的膠原蛋白纖維，其力學性能測試結(jié)果如圖2所示?？梢钥闯觯寒敊C械攪拌時間在8～11 h之間時，膠原蛋白纖維的斷裂強度呈現(xiàn)出明顯的增加趨勢，這表明膠原分子內(nèi)以及分子間的交聯(lián)反應在持續(xù)進行，酰胺鍵在不斷生成，膠原分子間的相互作用在不斷加強；當機械攪拌時間為11 h時，膠原蛋白纖維的斷裂強度達到最大值，隨后纖維的斷裂強度隨著原位交聯(lián)時間的增加呈現(xiàn)出明顯下降趨勢，這是因為過長的交聯(lián)時間導致交聯(lián)過度，使膠原分子內(nèi)部的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)遭到破壞[17]。

圖2 不同原位交聯(lián)時間的膠原蛋白纖維力學性能Fig.2 Mechanical properties of collagen fibers at different crosslinking times

分別將質(zhì)量分數(shù)為0%、5%、10%、15%和20%的EDC/NHS交聯(lián)劑溶于0.5 mol/L冰乙酸中，采用1.3節(jié)中原位交聯(lián)膠原蛋白纖維的制備方法，機械攪拌11 h，制備不同交聯(lián)劑質(zhì)量分數(shù)的原位交聯(lián)膠原蛋白纖維，其力學性能測試結(jié)果如圖3所示?？梢钥闯觯S著交聯(lián)劑質(zhì)量分數(shù)的增加，膠原蛋白纖維的斷裂強度呈現(xiàn)出明顯的先增長后下降的變化趨勢。其中當交聯(lián)劑質(zhì)量分數(shù)達到15%時，膠原蛋白纖維的斷裂強度最大，說明此時膠原蛋白纖維的交聯(lián)度達到最高。隨后膠原蛋白纖維的斷裂強度隨著交聯(lián)劑質(zhì)量分數(shù)的增加開始下降，這是因為過量的交聯(lián)劑導致膠原分子交聯(lián)過度，分子內(nèi)部的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)遭到破壞，進而使膠原蛋白纖維的斷裂強度降低。

圖3 不同原位交聯(lián)劑質(zhì)量分數(shù)的膠原蛋白纖維力學性能Fig.3 Mechanical properties of collagen fibers with different crosslinker concentrations

2.2.2 原位交聯(lián)膠原蛋白纖維的形貌分析

圖4、5分別示出不同交聯(lián)劑質(zhì)量分數(shù)制備的膠原蛋白纖維的表面和橫截面掃描電鏡照片。從圖4可看出，沒有進行交聯(lián)的膠原蛋白纖維表面相對比較粗糙，有明顯的褶皺存在。這主要是由于膠原分子柔性比較大，在雙擴散成型過程中丙酮脫水導致褶皺出現(xiàn)。隨著交聯(lián)劑質(zhì)量分數(shù)的增加，膠原蛋白纖維表面逐漸平整，皺褶開始減小，且出現(xiàn)明顯纖維化取向結(jié)構(gòu)[18]。圖5表明，隨著交聯(lián)劑質(zhì)量分數(shù)增加，膠原蛋白纖維內(nèi)部呈現(xiàn)出典型的帶狀原纖維結(jié)構(gòu)特征。這是因為初生纖維在固化過程中受后拉伸作用而形成有序的膠原分子自組裝聚集結(jié)構(gòu)。與圖5(a)相比，經(jīng)原位交聯(lián)的膠原蛋白纖維橫截面結(jié)構(gòu)更規(guī)整，顯微結(jié)構(gòu)也由交聯(lián)前的無序結(jié)構(gòu)變?yōu)榫o密的有序結(jié)構(gòu)[19]。

圖4 不同交聯(lián)劑質(zhì)量分數(shù)的膠原蛋白纖維表面掃描電鏡照片(×900)Fig.4 Surface SEM images of collagen fiber surface with different crosslinker concentrations (×900)

圖5 不同交聯(lián)劑質(zhì)量分數(shù)的膠原蛋白纖維橫截面掃描電鏡照片(×2 000)Fig.5 Cross section SEM images of collagen fiber profile with different crosslinker concentrations (×2 000)

綜上所述，原位交聯(lián)膠原蛋白纖維的最佳交聯(lián)時間為11 h，交聯(lián)劑質(zhì)量分數(shù)為15%，后續(xù)實驗制備原位交聯(lián)和交聯(lián)浴交聯(lián)纖維均采用這2個參數(shù)。

2.3 原位交聯(lián)與交聯(lián)浴交聯(lián)纖維性能分析

2.3.1 纖維結(jié)晶性能分析

拉伸過程可使初生纖維非晶區(qū)的大分子沿纖維軸向的取向顯著提高；同時，聚合物在拉伸過程中的形變能量傳遞也會導致初生纖維的取向提高，使纖維結(jié)晶度增加。初生纖維的超分子結(jié)構(gòu)經(jīng)過拉伸過程發(fā)生顯著變化，從而得到結(jié)構(gòu)更為完善、性能更為優(yōu)良的纖維[12]。不同交聯(lián)方式膠原蛋白纖維的X射線衍射曲線如圖6所示。可以看出，純膠原蛋白纖維的XRD曲線上主要有2個衍射峰。在2θ為7°左右存在1個尖銳的峰，代表膠原分子鏈間的距離；在2θ為20°附近有1個寬的饅頭峰，為膠原蛋白纖維內(nèi)部眾多結(jié)構(gòu)層次所引起的漫反射[19]。與純膠原蛋白纖維相比，經(jīng)過EDC/NHS交聯(lián)的膠原蛋白纖維在2θ為7°處的衍射峰要尖銳得多，強度也有所增加。這說明交聯(lián)纖維的分子間距有所減小，纖維內(nèi)部微纖的排列緊密有序，纖維的結(jié)晶度增大[20]。同時，在2θ為20°處衍射峰的變化是膠原蛋白纖維內(nèi)部復雜的多級結(jié)構(gòu)因交聯(lián)反應的發(fā)生而引起的。原位交聯(lián)纖維的峰強度均高于其他2種纖維，說明其結(jié)晶更加完善。對于交聯(lián)浴交聯(lián)來說，EDC/NHS的交聯(lián)反應主要發(fā)生在纖維的皮層，纖維內(nèi)部的反應并不充分；而在相同交聯(lián)條件下的原位交聯(lián)可使膠原的交聯(lián)反應充分進行，進而使?jié)穹徑z制備的膠原分子排列更規(guī)整、緊密，有序程度更高。

圖6 不同交聯(lián)方式的膠原蛋白纖維XRD曲線Fig.6 XRD curves of collagen fibers with different crosslinking modes

2.3.2 纖維化學結(jié)構(gòu)分析

圖7示出不同交聯(lián)方式的膠原蛋白纖維紅外譜圖。可以看出，純膠原蛋白纖維的紅外光譜主要出現(xiàn)了典型的酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和酰胺A帶與B帶吸收峰[21]。由EDC/NHS交聯(lián)膠原蛋白纖維的制備機制可知，膠原分子間的酰胺化將導致相對應的伯氨基數(shù)減小，酰胺鍵增加[14]。膠原蛋白纖維交聯(lián)前后的紅外光譜圖中主要表現(xiàn)為酰胺II帶(1 547 cm-1)與酰胺I帶(1 632 cm-1)吸收峰強度比值的減小，即1 547 cm-1處與1 632 cm-1處的吸收峰面積比值降低，上述這些吸收峰強度的變化表明交聯(lián)反應的發(fā)生[14]。原位交聯(lián)膠原蛋白纖維的酰胺II帶與酰胺I帶吸收峰強度比值明顯低于交聯(lián)浴交聯(lián)的膠原蛋白纖維，表明原位交聯(lián)更利于促進交聯(lián)反應的進行。

圖7 不同交聯(lián)方式的膠原蛋白纖維紅外譜圖Fig.7 Infrared spectra of collagen fibers with different crosslinking modes

2.3.3 纖維熱穩(wěn)定性分析

圖8示出不同交聯(lián)方式的膠原蛋白纖維TG曲線?？梢钥闯?，膠原蛋白纖維的熱質(zhì)量損失過程均包括2個階段。第1階段是膠原蛋白纖維中自由水和結(jié)合水在受熱揮發(fā)后導致的質(zhì)量損失，溫度范圍為60～200 ℃。原位交聯(lián)膠原蛋白纖維第2階段的質(zhì)量損失率和質(zhì)量損失速率都小于其他纖維，這說明原位交聯(lián)緊密的取向結(jié)構(gòu)結(jié)合的水分少。第2階段是膠原分子在受熱后發(fā)生斷裂引起的質(zhì)量損失，初始溫度在200 ℃左右，且隨著溫度的升高，斷裂形成的短鏈進一步降解造成質(zhì)量損失[13]。經(jīng)EDC/NHS交聯(lián)的膠原蛋白纖維的熱分解溫度高于純膠原蛋白纖維，這主要是因為交聯(lián)使膠原蛋白纖維在分子內(nèi)及分子間形成穩(wěn)定的交聯(lián)網(wǎng)絡，相互作用進一步增強，自組裝結(jié)構(gòu)完善，3股螺旋結(jié)構(gòu)相對更加穩(wěn)定[14]。在相同交聯(lián)時間、交聯(lián)劑質(zhì)量分數(shù)條件下，原位交聯(lián)后膠原蛋白纖維的熱分解溫度明顯高于交聯(lián)浴交聯(lián)膠原蛋白纖維。這表明在同等條件下，原位交聯(lián)可使膠原蛋白纖維獲得更高的交聯(lián)度。

圖8 不同交聯(lián)方式的膠原蛋白纖維TG曲線Fig.8 TG curves of collagen fiber with different crosslinking methods

2.3.4 纖維耐水溶性分析

由于膠原蛋白屬于水溶性蛋白質(zhì)，未經(jīng)改性處理的純膠原蛋白纖維遇水即溶，在濕態(tài)時幾乎沒有任何強度。EDC/NHS作為交聯(lián)劑可封閉膠原分子表面的親水官能團，從而降低膠原蛋白纖維的吸水率。表1示出不同交聯(lián)方式的膠原單纖維接觸角和吸水率。一般認為膠原蛋白纖維吸水率高于200%時即為濕態(tài)沒有強度[22]。由表1可知，經(jīng)EDC/NHS交聯(lián)后，膠原蛋白纖維在0、60 s時的單纖維接觸角均高于純膠原蛋白纖維。隨著水滴與膠原蛋白纖維的接觸時間增加，單纖維接觸角也在逐漸減小。同時，膠原蛋白纖維的吸水率變化與單纖維接觸角變化具有一致性，且經(jīng)原位交聯(lián)的膠原蛋白纖維吸水率降低幅度明顯高于交聯(lián)浴交聯(lián)。膠原蛋白纖維吸水率的降低與交聯(lián)度密切相關(guān)，交聯(lián)度越大，吸水率越低。這表明原位交聯(lián)膠原蛋白纖維的交聯(lián)度要高于交聯(lián)浴交聯(lián)。

表1 不同交聯(lián)方式的膠原蛋白單纖維接觸角和吸水率Tab.1 Contact angle and water absorption of collagen fibers with different crosslinking methods

2.3.5 纖維力學性能分析

表2示出不同交聯(lián)方式的膠原蛋白纖維力學性能?？梢钥闯?，經(jīng)交聯(lián)改性的膠原蛋白纖維斷裂強度均有增強，且原位交聯(lián)纖維的斷裂強度和斷裂伸長率提升最為明顯。原位交聯(lián)膠原蛋白纖維的斷裂強度可達(1.44±0.03)cN/dtex，較純膠原蛋白纖維提高了35.8%，較交聯(lián)浴交聯(lián)膠原蛋白纖維提高了19.0%。纖維在交聯(lián)浴中的交聯(lián)反應從纖維皮層開始，纖維表面會逐漸形成一層致密的疏水層，從而使交聯(lián)反應難以進行到纖維內(nèi)部，影響纖維的交聯(lián)效果；而原位交聯(lián)可使交聯(lián)劑與膠原充分反應，達到較好的交聯(lián)效果。

表2 不同交聯(lián)方式的膠原蛋白纖維力學性能Tab.2 Mechanical properties of collagen fibers with different cross-linking methods

3 結(jié) 論

1)EDC/NHS原位交聯(lián)膠原蛋白纖維的最佳時間為11 h，最佳交聯(lián)劑質(zhì)量分數(shù)為15%，在該條件下制備的膠原蛋白纖維的斷裂強度可達1.44 cN/dtex左右，較純膠原蛋白纖維提高了35.8%。

2)相比交聯(lián)浴交聯(lián)，EDC/NHS原位交聯(lián)膠原蛋白纖維性能提升更為顯著，且工藝更為簡單、省時。在相同交聯(lián)時間和交聯(lián)劑質(zhì)量分數(shù)條件下，原位交聯(lián)膠原蛋白纖維的斷裂強度較交聯(lián)浴交聯(lián)提高19.0%。

3)原位交聯(lián)膠原蛋白纖維的內(nèi)部微纖結(jié)構(gòu)相對于交聯(lián)浴交聯(lián)更加致密，膠原分子間通過酰胺鍵結(jié)合更加緊密；而交聯(lián)浴交聯(lián)主要發(fā)生在纖維的表面，內(nèi)部微纖結(jié)構(gòu)難以得到改善。EDC/NHS原位交聯(lián)膠原蛋白纖維作為一種簡便的交聯(lián)方式，可以顯著改善牛肌腱膠原蛋白纖維的結(jié)晶性、熱穩(wěn)定性和耐水溶性，有望為開發(fā)膠原基高端生物醫(yī)用纖維材料提供一種新的增強方式。