實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)監(jiān)測(cè)腌制麻竹筍中乳酸乳球菌動(dòng)態(tài)變化

夏雪娟，鄭 炯,2,，葉秀娟，吳金松，闞建全,2（.西 南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 40075；2.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 40075）

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)監(jiān)測(cè)腌制麻竹筍中乳酸乳球菌動(dòng)態(tài)變化

夏雪娟1，鄭 炯1,2,*，葉秀娟1，吳金松1，闞建全1,2
（1.西 南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715）

采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）技術(shù)定量監(jiān)測(cè)6 g/100 mL鹽質(zhì)量濃度腌制麻竹筍中乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）的動(dòng)態(tài)變化。經(jīng)乳酸乳球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA提取、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒制備、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制、各時(shí)期竹筍腌制發(fā)酵液中細(xì)菌基因組DNA提取和乳酸乳球菌qRTPCR特異性擴(kuò)增，對(duì)腌制液中乳酸乳球菌進(jìn)行定量檢測(cè)。結(jié)果表明，在腌制過(guò)程中（0～63 d），隨著腌制時(shí)間的延長(zhǎng)，乳酸乳球菌含量逐漸升高，在腌制14 d時(shí)達(dá)到最大值（4.63×108copies/?L），與0 d（2.41×102copies/?L）相比增加了6 個(gè)數(shù)量級(jí)，而后濃度緩慢降低，在腌制63 d時(shí)濃度為5.02×106copies/?L。qRT-PCR技術(shù)為定量監(jiān)測(cè)腌制麻竹筍中微生物的動(dòng)態(tài)變化提供了一條可靠、快速的有效途徑。

大葉麻竹筍；腌制；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；乳酸乳球菌；動(dòng)態(tài)變化

大葉麻竹筍（Dendrocalamus latiflorus）是著名的高產(chǎn)型竹筍，廣泛分布于我國(guó)南亞熱帶和熱帶地區(qū)[1]。腌制大葉麻竹筍加工簡(jiǎn)易，成本低廉，易于保存，且具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、獨(dú)特的風(fēng)味，深受消費(fèi)者的喜愛(ài)[2]。在腌制發(fā)酵過(guò)程中，麻竹筍會(huì)形成多種風(fēng)味化合物，使其具有特殊的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[3]。而在風(fēng)味形成過(guò)程中，除了其本身的風(fēng)味外，其他的風(fēng)味形成途徑均與微生物的發(fā)酵作用有關(guān)[4]，因此，了解麻竹筍腌制過(guò)程中優(yōu)勢(shì)微生物的動(dòng)態(tài)變化對(duì)于研究腌制麻竹筍的風(fēng)味品質(zhì)變化具有重要作用。

乳酸菌具有良好的感官特性和防腐特性，在蔬菜發(fā)酵過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[5]。其中，乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）可形成檸檬酸，參與乙酰風(fēng)味化合物的合成，并參與發(fā)酵初始風(fēng)味的形成[6]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外諸多學(xué)者從腌制發(fā)酵蔬菜中分離鑒定出乳酸乳球菌，并對(duì)其益生作用進(jìn)行研究。如付琳琳等[7]采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳技術(shù) 從不同家庭制作的成熟期的泡菜液中鑒定出乳酸乳球菌。尹軍霞等[8]研究了分離自酸菜汁的乳酸乳球菌的體外去除膽固醇特性。連元元等[9]從泡菜中提取并保存了一株泡菜乳酸乳球菌，并發(fā)現(xiàn)其具有較高的耐鎘能力。Seema等[10]從腌制山藥中分離出一株乳酸乳球菌并對(duì)其益生特性進(jìn)行初步研究。Aso等[11]從日本傳統(tǒng)“津田蕪菁”泡菜中分離出一株乳酸乳 球菌，并對(duì)其產(chǎn)Nisin Z的能力進(jìn)行探討。本課題組前期的研究也表明乳酸乳球菌是腌制麻竹筍中的優(yōu)勢(shì)菌群，但其 含量及在腌制加工過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化還有待進(jìn)一步研究[4]。

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）技術(shù)可定量研究微生物菌落結(jié)構(gòu)組成及數(shù)量變化，為全面、快速、準(zhǔn)確地分析鑒定食品[12-15]中的各種微生物提供了一種嶄新的技術(shù)工具和平臺(tái)。近年來(lái)，也有部分學(xué)者采用qRT-PCR技術(shù)對(duì)食品中的乳酸乳球菌進(jìn)行定量研究，如Grattepanche[6]和Achilleos[16]等分別采用qRT-PCR技術(shù)對(duì)混合發(fā)酵乳和芝士中的乳酸乳球菌進(jìn)行鑒定。而有關(guān)麻竹筍腌制過(guò)程中乳酸乳球菌的qRT-PCR研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)采用qRT-PCR技術(shù)對(duì)腌制麻竹筍中的乳酸乳球菌變化進(jìn)行定量監(jiān)測(cè)，以期為腌制麻竹筍中風(fēng)味物質(zhì)的形成及變化機(jī)理研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腌制麻竹筍：大葉麻竹筍原料采于重慶市北碚區(qū)施家梁鎮(zhèn)大葉麻竹筍種植基地，將麻竹筍洗凈、切分、漂燙、瀝干、冷卻后，按傳統(tǒng)加工方法加鹽（6 g/100 mL）在室溫條件下腌制。從腌制當(dāng)天開(kāi)始取樣，第3天取一次樣，之后每隔一周取一次樣，共取11 次樣（0、3、7、14、21、28、35、42、49、56 d和63 d），取樣完成時(shí)產(chǎn)品已基本成熟。樣品－20 ℃冰箱保存，至最后一次取樣完成后統(tǒng)一進(jìn)行DNA提取。

乳酸乳球菌乳亞種（Lactococcus lactis subsp. lactis）CGMCC1.1936 中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

MRS培養(yǎng)基用試劑及配制方法參照文獻(xiàn)[17]；基因組DNA提取和克隆用試劑及配制方法參考文獻(xiàn)[18]；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（DP302）、溶菌酶、瓊脂糖、GeneGreen核酸染料（RT210）、瓊脂糖凝膠回收試劑盒（DP209）、pGM-T克隆試劑盒（VT202）、DH5α感受態(tài)細(xì)胞（CB101-03）、質(zhì)粒小提試劑盒（DP103） 天根生化科技（北京）有限公司；TaKaRa Taq擴(kuò)增體系套裝（R001A）、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（DRR820A） 寶生物工程（大連）有限公司；毛細(xì)管 上海大菱制塑有限公司；Lambda DNA/Hind ⅢMarker（NMW009）、100 bp ladder Ⅱ（NMW004）北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；實(shí)驗(yàn)所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

S1000伯樂(lè)1000系列高性能PCR儀、164-5050基礎(chǔ)電源電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；Syngene GeneGenius凝膠成像系統(tǒng) 基因科技（上海）有限公司；LightScanner 32熒光定量PCR儀 美國(guó)Idaho公司；NanoDrop 2000微量紫外分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo公司；SIM-F140AY65型制冰機(jī) 三洋電機(jī)國(guó)際貿(mào)易有限公司；SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；1-15PK小型臺(tái)式離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；ES-315高壓滅菌鍋日本Tomy公司；HWS-26電熱恒溫水浴鍋、DHP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

1.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株模板DNA的制備

將乳酸乳球菌按照標(biāo)準(zhǔn)菌株培養(yǎng)條件接種至MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，經(jīng)2 次活化后采用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA。用溶菌酶對(duì)菌體進(jìn)行破壁處理，提取結(jié)束時(shí)用80 μL TE buffer將DNA溶出。經(jīng)0.8%瓊脂糖凝聚電泳，GeneGreen染色檢測(cè)后，－20 ℃保存?zhèn)溆?，目?biāo)片段應(yīng)在23 kb左右[19]。

1.3.1.2 目的片段的擴(kuò)增純化

采用特異性引物對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，用以制備標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒[20]。正向引物L(fēng). lactis-F：5’-TGA AGA ATT GAT GGA ACT CG-3’，反向引物L(fēng). lactis-R：5’-CAT TGT GGT TCA CCG TTC-3’，目標(biāo)片段約為126 bp[16]。擴(kuò)增體系為：5 μL DNA模板，正向和反向引物各0.25 μL，10×PCR buffer（Mg2＋plus）10 μL，dNTP Mixture 3 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，滅菌超純水補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性40 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用無(wú)菌手術(shù)刀在紫外燈下切取目標(biāo)片段，并采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒對(duì)其進(jìn)行純化回收?；厥债a(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純度后－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.3 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒的制備[21]

使用天根pGM-T克隆試劑盒將已純化標(biāo)準(zhǔn)菌株目的片段與質(zhì)粒進(jìn)行連接，并將4 ?L連接反應(yīng)物加入至50 ?L DH5α感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化。利用藍(lán)白斑篩選法挑選白色陽(yáng)性克隆菌落后采用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，具體操作詳見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

為避免質(zhì)粒假陽(yáng)性，采用通用引物T7（5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3’）和SP6（5’-ATT TAG GTG ACA CTA TAG-3’）對(duì)提取質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用做熒光定量PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。擴(kuò)增體系同1.3.1.2節(jié)，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用3%的瓊脂糖凝膠電泳和微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度與純度后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.3.1.4 qRT-PCR條件優(yōu)化

以L. lactis-F和L. lactis-R為引物，以得到最小的Ct值（熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）、最大的熒光值和熔解曲線不產(chǎn)生非特異性峰為指標(biāo)，對(duì)乳酸乳球菌qRT-PCR的退火溫度、退火時(shí)間、引物濃度以及熒光數(shù)據(jù)收集溫度等條件進(jìn)行優(yōu)化，確定擴(kuò)增的最佳條件[22]。

1.3.1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[12,23]

由微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒PCR產(chǎn)物濃度，結(jié)合產(chǎn)物測(cè)序得到的片段大小，根據(jù)公式（1）計(jì)算出PCR產(chǎn)物中所含的初始拷貝數(shù)。

稀釋質(zhì)粒擴(kuò)增產(chǎn)物，觀察不同濃度模板對(duì)擴(kuò)增效率及熒光吸收強(qiáng)度的影響，從而確定合適的模板濃度范圍。在合適的濃度范圍內(nèi)以無(wú)菌超純水連續(xù)10 倍梯度稀釋?zhuān)瑢⑵渥鳛殛?yáng)性模板，按照優(yōu)化后的條件進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，得到不同濃度梯度模板的PCR擴(kuò)增曲線圖。再以不同濃度陽(yáng)性模板的拷貝數(shù)對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)菌株的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)（R2）。

1.3.2 各時(shí)期竹筍腌制發(fā)酵液中乳酸乳球菌含量的qRT-PCR檢測(cè)

取3 mL各時(shí)期竹筍腌制發(fā)酵液，10 000 r/min離心1 min，棄上清液，加入180 ?L 20 mg/mL的溶菌酶，37 ℃處理2 h后采用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA。DNA用80 μL TE buffer溶出后置于－20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用?yōu)化好的qRT-PCR條件和體系對(duì)各時(shí)期竹筍腌制發(fā)酵液細(xì)菌基因組DNA中乳酸乳球菌含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin（Version 8.6）和Excel（Version 2013）軟件進(jìn)行處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株模板DNA提取結(jié)果

乳酸乳球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA電泳結(jié)果見(jiàn)圖1，菌株基因組DNA在目標(biāo)位置處有亮帶，且無(wú)拖尾，說(shuō)明基因組質(zhì)量較好。

圖1 乳酸乳球菌DNA凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of L. lactis genomic DNA

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒制備結(jié)果

圖2 乳酸乳球菌常規(guī)PCR及陽(yáng)性質(zhì)粒PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified products of L. lactis and its positive plasmids

以提取的乳酸乳球菌基因組DNA為模板，經(jīng)特異性引物常規(guī)PCR擴(kuò)增后，對(duì)目的片段進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、克隆，再采用通用引物T7和SP6對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增。常規(guī)PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，常規(guī)PCR和質(zhì)粒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶均清晰，無(wú)雜帶、無(wú)拖尾，且常規(guī)PCR產(chǎn)物片段大小在126 bp左右，與預(yù)期結(jié)果一致。由于質(zhì)粒擴(kuò)增得到的片段是目的片段與pGM-T載體的部分序列（約145 bp）的連接產(chǎn)物，因此菌株的陽(yáng)性質(zhì)粒擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為271 bp，與圖中一致。

經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，菌株陽(yáng)性質(zhì)粒擴(kuò)增產(chǎn)物的OD260nm為5.266±0.220，OD280nm為2.846±0.072，O D260nm/O D280nm為1.8 5±0.0 3，質(zhì)量濃度為（263.3±11.0） ng/μL，質(zhì)量較好。經(jīng)序列分析，除去兩端質(zhì)粒片段，得到127 bp的目的片段，與預(yù)期結(jié)果相一致。且經(jīng)BLAST比對(duì)（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi）所得序列與乳酸乳球菌乳亞種（Lactococcus lactis subsp. lactis）的核苷酸序列同源性為100%，說(shuō)明所構(gòu)建的重組質(zhì)粒含有目的片段，可作為標(biāo)準(zhǔn)品用于qRT-PCR中。2.1.3 qRT-PCR反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果經(jīng)優(yōu)化，擴(kuò)增采用25 ?L的反應(yīng)體系，反應(yīng)體系見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR反應(yīng)體系Table 1 Reaction system for qRT-PCR amplification

利用SYBR Green Ⅰ染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，選擇兩步法PCR擴(kuò)增程序進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)椋旱谝徊剑?5 ℃預(yù)變性30 s，20 ℃/s，1 個(gè)循環(huán)，不采集信號(hào)；第二步：95 ℃變性5 s，20 ℃/s，60 ℃退火20 s，20 ℃/s，每個(gè)循環(huán)采集熒光信號(hào)，50 個(gè)循環(huán)。熔解程序?yàn)椋?5 ℃、0 s，20 ℃/s；65 ℃、15 s，20 ℃/s；95 ℃、0 s，0.1 ℃/s，持續(xù)采集信號(hào)；50 ℃冷卻30 s，20 ℃/s。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

對(duì)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行系列稀釋?zhuān)?0－2、10－4、10－6、10－8、10－10），采用優(yōu)化的條件進(jìn)行qRT-PCR，不同濃度梯度陽(yáng)性模板的PCR擴(kuò)增熒光曲線圖如圖3A所示，其熔解曲線見(jiàn)圖3B。由圖3可知，各濃度擴(kuò)增產(chǎn)物均在（78.7±0.4） ℃出現(xiàn)熒光峰值，無(wú)雜峰，說(shuō)明產(chǎn)物均一性良好，無(wú)非特異擴(kuò)增[24]。以相對(duì)拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)，得出菌株標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為：y=－3.868x＋45.142，R2=0.998 5，線性關(guān)系良好。

圖3 乳酸乳球菌熒光定量PCR熒光曲線（A）與熔解曲線（B）Fig.3 Quantitative PCR fluorescence and melting curves for Lactococcus lactis

2.2 各時(shí)期竹筍腌制發(fā)酵液中乳酸乳球菌含量檢測(cè)結(jié)果

由于3 mL腌制發(fā)酵液中細(xì)菌較少，細(xì)菌基因組DNA條帶較暗，故未提供其電泳結(jié)果。采用優(yōu)化好的qRTPCR條件和體系對(duì)各時(shí)期竹筍腌制發(fā)酵液中乳酸乳球菌含量進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)熔解曲線分析PCR產(chǎn)物的特異性，根據(jù)樣品的擴(kuò)增曲線可計(jì)算得出Ct值，再帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，可得各樣品中乳酸乳球菌的拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值（lgC）見(jiàn)圖4。使用Power函數(shù)對(duì)縱坐標(biāo)進(jìn)行換算，得出各時(shí)期竹筍腌制發(fā)酵液中乳酸乳球菌的拷貝數(shù)，在腌制0～3 d時(shí)，乳酸乳球菌含量略有上升，但濃度較低（分別為2.41×102copies/?L和1.78×103copies/?L）。隨著腌制時(shí)間的延長(zhǎng)，乳酸乳球菌濃度迅速升高，在腌制7 d時(shí)濃度為3.47×105copies/?L，而在腌制14 d時(shí)達(dá)到最大值，含量為4.63×108copies/?L，與腌制0 d相比增加了6 個(gè)數(shù)量級(jí)。之后濃度緩慢下降，在腌制21～63 d期間，乳酸乳球菌濃度從1.40×108copies/?L波動(dòng)下降至5.02×106copies/?L。

圖4 麻竹筍腌制液中乳酸乳球菌的動(dòng)態(tài)變化Fig.4 Changes in of Lactococcus lactis concentration in pickled ma bamboo shoots during pickling

3 討論與結(jié)論

本研究采用qRT-PCR技術(shù)對(duì)6 g/100 mL鹽質(zhì)量濃度腌制麻竹筍發(fā)酵液中乳酸乳球菌含量的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行監(jiān)控。經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA提取、擴(kuò)增、克隆、制備出標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒，再經(jīng)擴(kuò)增獲得陽(yáng)性模板，再用優(yōu)化后的qRT-PCR技術(shù)制備出標(biāo)準(zhǔn)曲線。提取各時(shí)期竹筍腌制發(fā)酵液中細(xì)菌基因組DNA，對(duì)其中乳酸乳球菌的含量進(jìn)行qRT-PCR定量檢測(cè)。結(jié)果表明，隨著腌制時(shí)間的延長(zhǎng)，乳酸乳球菌的含量逐漸升高，在腌制14 d時(shí)達(dá)到最大值（4.63×108copies/?L），而后濃度緩慢降低，在腌制63 d時(shí)濃度為5.02×106copies/?L。

乳酸乳球菌（L. l a c t i s）歸屬于硬壁菌門(mén)（F i r m i c u t e s）桿菌綱（B a c i l l i）乳桿菌目（Lactobacillales）鏈球菌科（Streptococcaceae）乳球菌屬（Lactococcus）[25]。Aso[11]和Harri[26]等研究表明乳酸乳球菌能在發(fā)酵初期產(chǎn)生細(xì)菌素Nisin，抑制存在于鹽水中的一些食源性致病菌和一些革蘭氏陰性菌生長(zhǎng)，且乳酸乳球菌為同型發(fā)酵，通過(guò)糖酵解途徑產(chǎn)生乳酸。Xiong Tao等[27]研究表明，乳酸乳球菌在酸菜腌制過(guò)程中生長(zhǎng)速度快，且產(chǎn)酸能力強(qiáng)，但耐酸能力差。本課題組之前的研究也表明，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，麻竹筍發(fā)酵液pH值逐漸降低[2]。因此，可推測(cè)本研究中乳酸乳球菌濃度先升高再降低的原因是由于發(fā)酵開(kāi)始時(shí)乳酸乳球菌產(chǎn)酸、產(chǎn)細(xì)菌素，抑制了其他細(xì)菌的生長(zhǎng)，使得它的濃度迅速升高，而隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液pH值降低，乳酸乳球菌活力下降。Xiong Tao等[28]研究表明，在泡菜發(fā)酵過(guò)程中，乳酸乳球菌在發(fā)酵初期慢慢出現(xiàn)，在后期死亡，與本研究相一致。

綜上所述，qRT-PCR技術(shù)為腌制麻竹筍中的微生物動(dòng)態(tài)變化的定量監(jiān)測(cè)提供了一條可靠、快速的有效途徑。本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)腌制大葉麻竹筍中乳酸乳球菌的定量變化進(jìn)行了檢測(cè)，進(jìn)一步的研究可對(duì)腌制麻竹筍中不同微生物進(jìn)行定量檢測(cè)，以探討腌制發(fā)酵液中微生物的交互作用對(duì)其風(fēng)味物質(zhì)的形成作用，為麻竹筍的風(fēng)味形成機(jī)理和腌制工藝的改進(jìn)提供一定的參考依據(jù)。

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Detection of Lactococcus lactis in Pickled Ma Bamboo Shoots by Quantitative Real-time PCR

XIA Xuejuan1, ZHENG Jiong1,2,*, YE Xiujuan1, WU Jinsong1, KAN Jianquan1,2
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. Chongqing Engineering Research Center of Regional Food, Chongqing 400715, China)

The dynamic changes of Lactococcus lactis in pickled Ma bamboo shoots with 6 g/100 mL salt concentration were studied by quanti tative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). After the DNA extraction from standard Lactococcus lactis, preparation of positive plasmids, protraction of standard curve, DNA extraction from samples at different fermentation stages and qRT-PCR, and quantitative detection were performed. The results showed that during fermentation (0–63 days), the concentration of Lactococcus lactis increased gradually from 2.41 × 102copies/?L (day 0) to the maximum value of 4.63 × 108copies/?L (day 14), an increase by six orders of magnitude, followed by a slow decrease to 5.02 × 106copies/?L at day 63. In conclusion, qRT-PCR technology provides a reliable, fast and effective way for the quantitative analysis of bacteria in pickled Ma bamboo shoots.

Ma bamboo shoots (Dendrocalamus latiflorus); pickling; quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR); Lactococcus lactis; dynamic changes

10.7506/spkx1002-6630-201604016

TS201.3

A

1002-6630（2016）04-0088-05

夏雪娟, 鄭炯, 葉秀娟, 等. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)監(jiān)測(cè)腌制麻竹筍中乳酸乳球菌動(dòng)態(tài)變化[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(4): 88-92. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604016. http://www.spkx.net.cn

XIA Xuejuan, ZHENG Jiong, YE Xiujuan, et al. Detection of Lactococcus lactis in pickled ma bamboo shoots by quantitative real-time PCR[J]. Food Science, 2016, 37(4): 88-92. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604016. http://www.spkx.net.cn

2015-03-29

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)（XDJK2013C131）；重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心能力提升項(xiàng)目（cstc2014pt-gc8001）

夏雪娟（1988—），女，博士研究生，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營(yíng)養(yǎng)學(xué)。E-mail：xiaxuej1989@163.com

*通信作者：鄭炯（1982—），男，講師，博士，研究方向?yàn)楣呒庸づc質(zhì)量控制。E-mail：zhengjiong_swu@126.com