RNA干擾機(jī)制及在病毒檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用

鄭 旸，康曉平，楊銀輝

RNA干擾機(jī)制及在病毒檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用

鄭 旸，康曉平，楊銀輝

RNA干擾；病毒檢測(cè)

近年來，有關(guān)RNA干擾的機(jī)制及應(yīng)用成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。RNA干擾的應(yīng)用已經(jīng)從基因組學(xué)研究逐步擴(kuò)展到醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。利用RNA干擾不僅能提供一種經(jīng)濟(jì)、快捷、高效的抑制基因表達(dá)的技術(shù)，在諸多領(lǐng)域如病毒的檢測(cè)方面也具有非常廣闊的應(yīng)用前景。

1 RNA干擾現(xiàn)象及其機(jī)制

1.1 RNA干擾現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn) 1990年初，Napol i等[1]在矮牽?；ㄖ袑?dǎo)入與花青素合成有關(guān)的查爾酮合成酶基因，本以為轉(zhuǎn)基因的牽?；〞?huì)變得更鮮艷，結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)，一些花反而被漂白了。這種過度表達(dá)內(nèi)源基因而引發(fā)的基因沉默被稱為共阻遏。Carvalho等[2]在純合子植物、Brusslan等[3]在擬南芥屬、Angenent等[4]在喇叭花中又相繼發(fā)現(xiàn)了類似的共阻遏現(xiàn)象，即內(nèi)源和外源轉(zhuǎn)入的基因轉(zhuǎn)錄本在轉(zhuǎn)錄后水平都顯著減少，出現(xiàn)明顯的基因沉默現(xiàn)象。除了植物，1992年Romano等[5]在粗糙鏈孢霉中發(fā)現(xiàn)了外源導(dǎo)入基因可以抑制具有同源序列的內(nèi)源基因的表達(dá)，1995年，Guo等[6]在線蟲中也發(fā)現(xiàn)了類似的基因沉默現(xiàn)象。1998年Fire等[7]發(fā)現(xiàn)所謂的基因沉默現(xiàn)象是由于部分mRNA被同源的dsRNA降解，導(dǎo)致相關(guān)基因的表達(dá)受到抑制，他們正式將這種現(xiàn)象命名為RNA干擾。而Fire等也由于在RNA干擾研究中的貢獻(xiàn)獲得2006年的諾貝爾生理及醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。

1.2 RNA干擾的機(jī)制 RNA干擾（RNAi）是正常生物體內(nèi)抑制特定基因表達(dá)的一種現(xiàn)象，是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈RNA（dsRNA）誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。這種現(xiàn)象發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平。RNAi與轉(zhuǎn)錄后基因沉默在分子層次上被證實(shí)是同一種現(xiàn)象，又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS）。RNAi是基因轉(zhuǎn)錄后沉默的一種方式，是生物界古老而且進(jìn)化的高度保守的現(xiàn)象之一。

外源dsRNA進(jìn)入細(xì)胞后可被宿主RNA干擾機(jī)制識(shí)別，進(jìn)而募集核酸內(nèi)切酶將dsRNA剪切加工為小干擾RNA（siRNA），產(chǎn)生的siRNA的反義鏈和多種核酸酶形成了沉默復(fù)合物（RISC），RISC具有結(jié)合和切割mRNA的作用從而介導(dǎo)RNA干擾的過程，見圖1。

圖1 細(xì)胞內(nèi)的RNA干擾機(jī)制圖

2 RNAi的種類及其作用機(jī)制

RNAi現(xiàn)象是由生物體內(nèi)一類非編碼的雙鏈小RNA所介導(dǎo)的，而內(nèi)源小RNA種類各異，主要可歸納為3類：miRNA（microRNA）、siRNA和piRNA（piwiRNA）。針對(duì)miRNA和siRNA的研究起步較早，研究也較為深入。自2006年發(fā)現(xiàn)piRNA后又一次掀起了小RNA研究的熱潮[8]。本文著重介紹miRNA和siRNA。

2.1 miRNA miRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70～90個(gè)堿基大小的單鏈 RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成，它們?cè)趧?dòng)植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控。miRNA能夠通過與靶mRNA特異性的堿基互補(bǔ)配對(duì)，引起靶mRNA降解或者抑制其翻譯，從而對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)調(diào)控。miRNA在細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育過程的調(diào)節(jié)過程中起多種作用。第一個(gè)被確認(rèn)的miRNA是在線蟲中首次發(fā)現(xiàn)的l in-4和let-7，隨后多個(gè)研究小組在包括人類、果蠅、植物等多種生物物種中鑒別出數(shù)百個(gè)miRNA。

miRNA與靶mRNA的作用模式有如下幾種：當(dāng)二者不完全互補(bǔ)，即二者不完全配對(duì)結(jié)合時(shí)，主要影響翻譯過程而對(duì)mRNA的穩(wěn)定性無任何影響[9]（哺乳動(dòng)物中比較普遍），如線蟲的l in-4。然而，最近也有證據(jù)表明，有些miRNA也有可能影響mRNA的穩(wěn)定性，這類miRNA的結(jié)合位點(diǎn)通常在mRNA的3′端非編碼區(qū)。當(dāng)二者完全互補(bǔ)，即二者完全配對(duì)結(jié)合后，類似siRNA與靶mRNA的結(jié)合，特異性地切割mRNA（在植物中比較常見），如miR39/miR171。此時(shí)miRNA也能像siRNA一樣識(shí)別切割靶mRNA[10]。通過這種機(jī)制作用的miRNAs結(jié)合位點(diǎn)通常都在mRNA的編碼區(qū)或開放閱讀框中。

2.2 siRNA siRNA也是一種長(zhǎng)度為21～25 nt的小RNA，其中包括5個(gè)磷酸鹽、2個(gè)核苷和3個(gè)懸臂，在RNA沉默過程中起主要作用。siRNA和miRNA均屬于非編碼RNA（ncRNA），且都是長(zhǎng)度約21～25 nt的小分子RNA（smal l RNA），二者關(guān)系密切。雖然siRNA和miRNA非常相似，但是它們的產(chǎn)生途徑、功能以及對(duì)靶RNA的作用都是有所區(qū)別的。對(duì)siRNA和miRNA進(jìn)行比較[11]，見表1。

正如前面提到的miRNA與靶mRNA的作用模式中，miRNA有一種作用模式類似于siRNA與靶mRNA的結(jié)合，同樣，Doench等[12]發(fā)現(xiàn)，在siRNA與靶RNA的作用模式中，也有一些siRNA可以像miRNA那樣，它主要影響翻譯過程，抑制基因的表達(dá)而不影響mRNA的穩(wěn)定性。因而miRNA與siRNA之間并不存在嚴(yán)格意義上的界限，既有個(gè)性也有共性。

另外，Pak等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在RNA干擾過程中，存在一類特殊的小RNA群體，即次級(jí)siRNA，能導(dǎo)致不同種群之間出現(xiàn)不同的初級(jí)和次級(jí)效應(yīng)。同時(shí)，Si jen等[14]發(fā)現(xiàn)幾個(gè)次級(jí)siRNA序列開始于一些初級(jí)siRNA下游，因而推測(cè)次級(jí)siRNA是一種不同類型的小RNA，其產(chǎn)生依賴于RNA聚合酶（RdRP）。在線蟲中，初級(jí)siRNAs可作為RdRP的模板產(chǎn)生次級(jí)siRNAs。這種信號(hào)放大過程是線蟲的RNAi效應(yīng)所必需的[15-16]。

3 RNAi在病毒檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用

自從發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象以來，RNAi一直是生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)。RNAi作為后基因組時(shí)代的一種下調(diào)基因表達(dá)的工具已被廣泛用于基因功能的研究、疾病的診斷、基因治療、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和病原微生物檢測(cè)等方面，下面我們以病毒為例，著重闡述一下RNAi在病毒檢測(cè)方面的應(yīng)用。

RNAi是節(jié)肢動(dòng)物抗病毒的關(guān)鍵機(jī)制，蟲媒病毒的感染能夠誘發(fā)RNAi機(jī)制，近些年關(guān)于RNAi的研究多見于病毒致病或者宿主抗病毒的機(jī)制研究，極少應(yīng)用于病原微生物檢測(cè)等方面。Myles等[17]研究表明，蟲媒病毒在自然界中的維持需要一個(gè)生物鏈循環(huán)，脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物（包括蚊等）對(duì)于病毒入侵產(chǎn)生的響應(yīng)不同。病毒在人和節(jié)肢動(dòng)物中導(dǎo)致了較為明顯的發(fā)病率和死亡率，而在蚊蟲體內(nèi)卻存在著一種抗病毒的RNAi機(jī)制，限制了病毒的復(fù)制。他們?cè)诟腥静《镜奈皿w內(nèi)獲得了長(zhǎng)度為21 nt的病毒源性siRNAs，它們橫跨了整個(gè)病毒的基因組并且有著不對(duì)稱的分布，研究結(jié)果表明一個(gè)外生的siRNA途徑對(duì)于感染病毒的蚊來說是至關(guān)重要的，也是某些病毒能夠在自然界中維持的原因。Orban等[18]研究了在果蠅細(xì)胞中被RISC作為目標(biāo)的mRNA的降解途徑，長(zhǎng)的dsRNA分子首先要被核酸內(nèi)切酶加工成21～22 nt的siRNAs，它們被結(jié)合成RISC，并利用互補(bǔ)性來裂解mRNA。Myles等[19]同樣發(fā)現(xiàn)許多蟲媒病毒在自然界中的持續(xù)傳播依靠的是一個(gè)固定的、無病毒感染的蚊載體的確立，進(jìn)一步表明了蚊中由小RNA指導(dǎo)的抗病毒免疫的重要性，同時(shí)導(dǎo)致RNA沉默的這些小RNA的起源也成了討論的話題。最后他們總結(jié)出了一些證據(jù)表明蚊蟲中甲病毒在復(fù)制過程中產(chǎn)生的雙鏈中間體引發(fā)了一種外生的siRNA途徑，也就成了病毒源性siRNAs的起源。

表1 siRNA和miRNA的比較

Nakamura等[20]應(yīng)用了一種新的高通量測(cè)序的方法對(duì)他們采集到的鼻咽和排泄物樣本中的病毒進(jìn)行了檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了他們的高通量測(cè)序方法是有效的，可以不需要進(jìn)一步的遺傳信息。盡管主要的讀長(zhǎng)是宿主源性基因組，但是所測(cè)得的不同病毒小片段也覆蓋了78%～98%的病毒基因組，對(duì)于發(fā)現(xiàn)一些很難用傳統(tǒng)手段檢測(cè)的新病毒還是很有利的。這項(xiàng)高通量測(cè)序技術(shù)若應(yīng)用于RNAi機(jī)制中產(chǎn)生的siRNAs的檢測(cè)，可用于病毒的發(fā)現(xiàn)。Scot t等[21]利用登革2型病毒同時(shí)感染蚊Aag2細(xì)胞和C6/36細(xì)胞株，并采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)兩者產(chǎn)生的病毒小RNAs進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)Aag2內(nèi)的小RNA均是長(zhǎng)dsRNA被Dicer裂解后的產(chǎn)物，而C6/36細(xì)胞株卻不能有效利用Dicer來裂解長(zhǎng)的dsRNA，表明Aag2細(xì)胞宜于產(chǎn)生siRNA而C6/36細(xì)胞不能有效利用Dcr2這個(gè)RNAi途徑的關(guān)鍵起始因子來裂解長(zhǎng)的dsRNAs。

Qingfa Wu等[22]闡述了蟲媒病毒感染宿主細(xì)胞后引發(fā)的RNAi機(jī)制，并同時(shí)介紹了siRNAs、miRNAs和piRNAs。他們利用FHV（f lock house virus）的B2缺失突變體感染果蠅S2細(xì)胞、用FHV感染轉(zhuǎn)基因線蟲以及用SINV（sindbis virus）感染成年蚊，對(duì)被感染的宿主中總的小RNA進(jìn)行高通量測(cè)序以獲得病毒siRNAs，在多次的測(cè)序之后，通過對(duì)siRNAs序列進(jìn)行比對(duì)和拼接，產(chǎn)生不同的重疊群，與病毒的全基因組進(jìn)行比較，證明在果蠅、蚊和線蟲中產(chǎn)生的病毒siRNAs在序列上是重疊的，并可以用于病毒基因組的組裝。在這項(xiàng)研究中，研究人員描述了一種能通過無脊椎動(dòng)物中病毒siRNAs的高通量測(cè)序和裝配來發(fā)現(xiàn)病毒的方法，而這些siRNAs是宿主對(duì)于感染的免疫應(yīng)答過程中所產(chǎn)生的。

從RNAi現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)至今，已逐步闡明其結(jié)構(gòu)、功能及機(jī)制，并將其廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究中。在病毒檢測(cè)方面，可以將siRNAs視為病毒基因組的鏡像片段，通過高通量測(cè)序的方法獲得siRNAs并對(duì)siRNAs進(jìn)行裝配和拼接，獲得病毒的全基因組片段，通過將高通量技術(shù)與RNAi相結(jié)合，可以直接對(duì)小RNA進(jìn)行高通量測(cè)序，能夠快速檢測(cè)已知及發(fā)現(xiàn)未知蟲媒病毒。雖然人類對(duì)于RNAi的研究越來越深入，但是仍然存在許多未知的領(lǐng)域和許多沒有解決的關(guān)鍵性問題，例如在病毒檢測(cè)中還需明確不同種屬病毒對(duì)于RNAi反應(yīng)的影響、siRNA的產(chǎn)生與病毒復(fù)制過程之間的關(guān)系、感染滴度與siRNA生成量的關(guān)系以及針對(duì)小片段哪種拼接算法最優(yōu)化等等；當(dāng)然，小RNA的生成途徑、作用機(jī)制以及生物學(xué)功能仍需進(jìn)一步明確。目前所發(fā)現(xiàn)的小RNA只是全部小RNA的冰山一角，而且許多已發(fā)現(xiàn)的小 RNA的功能還有待進(jìn)一步探索。雖然面臨許多困難，但是在科學(xué)家們不斷地研究和探索中，RNAi技術(shù)終將被撕開一層層面紗，為人類所掌握并很好地應(yīng)用于我們的生產(chǎn)生活當(dāng)中，發(fā)揮更為重要的作用。

[1] Napol i C，Lemieux C，Jorgensen R.Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia resul ts in reversible co-suppression of homologous genes in t rans[J].Plant Cel l，1990，2（4）：279-289.

[2] de Carvalho F，Gheysen G，Kushnir S，et al.Suppression of beta-1，3-glucanase t ransgene expression in homozygous plants[J].EMBO J，1992，11（7）：2595-2602.

[3] Brusslan JA，Kar l in-Neumann GA，Huang L，et al.An Arabidopsis mutant with a reduced level of cab140 RNA is a resul t of cosuppression[J]. Plant Cel l，1993，5（6）：667-677.

[4] Angenent GC，F(xiàn)ranken J，Busscher M，et al.Co-suppression of the petunia homeotic gene fbp2 affects the identity of the generative meristem [J].Plant J，1994，5（1）：33-44.

[5] Romano N,Macino G.Quel ling：t ransient inactivation of gene expression in Neurospora crassa by t ransformation with homologous sequences [J].Mol Microbiol，1992，6（22）：3343-3353.

[6] Guo S,Kemphues KJ.Par-1，a gene required for establishing polarity in C.elegans embryos，encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrical ly distributed[J].Cel l，1995，81（4）：611-620.

[7] Fire A，Xu S，Montgomery MK，et al.Potent and specif ic genetic inter ference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J].Nature，1998，391（6669）：806-811.

[8] 李 澤，白荷露.小RNA的組成和功能——三類內(nèi)源小RNA的研究概況[J].生物技術(shù)通報(bào)，2013（1）：25-30.

[9] Lu JJ，Liao WB，Peng M.The Progress of MicroRNA Research[J].Molecular Plant Breeding，2006，4（6）：73-77.

[10]Cerut ti H.RNA inter ference：t ravel ing in the cel l and gaining functions[J].Trends Genet，2003，19（1）：39-46.

[11]彭輝兵，全智華.RNA干擾——一種有力的基因沉默工具[J].醫(yī)學(xué)綜述，2007，13（3）：177-180.

[12]Doench JG，Petersen CP，Sharp PA.siRNAs can function as miRNAs[J].Genes Dev，2003，17（4）：438-442.

[13]Pak J，F(xiàn)ire A.Distinct populations of primary and secondary ef fectors during RNAi in C.elegans［J］.Science，2007，315（5809）：241-244.

[14]Si jen T，Steiner FA，Thijssen KL，et al.Secondary siRNAs resul t f rom unprimed RNA synthesis and form a distinct class[J].Science，2007，315（5809）：244-247.

[15]Si jen T，F(xiàn)leenor J，Simmer F，et al.On the role of RNA ampl if ication in dsRNA-t riggered gene si lencing[J].Cel l，2001，107（4）：465-476.

[16]Smardon A，Spoerke JM，Stacey SC，et al.EGO-1 is related to RNA-directed RNA polymerase and functions in germ-l ine development and RNA inter ference in C.elegans[J].Cur r Biol，2000，10（4）：169-178.

[17]Myles KM，Wi ley MR，Morazzani EM，et al.Alphavirus-derived smal l RNAs modulate pathogenesis in disease vector mosquitoes[J].Proc Nat l Acad Sci USA，2008，105（50）：19938-19943.

[18]Orban TI,Izaurralde E.Decay of mRNAs targeted by RISC requires XRN1，the Ski complex，and the exosome[J].RNA，2005，11（4）：459-469.

[19]Myles KM,Morazzani EM,Adelman ZN.Adelman.Origins of alphavirus-derived smal l RNAs in mosquitoes[J].RNA Biol，2009，6（4）：387-391.

[20]Nakamura S,Yang CS,Sakon N,et al.Direct Metagenomic Detection of Viral Pathogens in Nasal and Fecal Specimens Using an Unbiased High-Throughput Sequencing Approach[J].PLOS One，2009，4（1）：e4219.

[21]Scot t JC，Brackney DE，Campbel l CL，et al.Comparison of Dengue Virus Type 2-Speci fic Smal l RNAs f rom RNA Inter ference-Competent and–Incompetent Mosquito Cel ls[J].PLoS Negl Trop Dis,2010,4(10)：e848.

[22]Qingfa Wu，Yingjun Luo，Rui Lu，et al.Virus discovery by deep sequencing and assembly of virus-derived smal l si lencing RNAs[J].PNAS，2010，107（4）：1606-1611.

（收稿：2013-08-21 修回：2013-09-02 編校：齊 彤）

Q 75

A

2095-3496（2013）04-0263-04

100071 北京，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院五所（鄭 旸，康曉平，楊銀輝）