不同方法制備的黃連解毒湯提取液指紋圖譜比較分析

摘要：

目的：比較分析SBE法（半仿生提取法）、AE法（醇提取法）制備的黃連解毒湯提取液的指紋圖譜，以驗(yàn)證黃連解毒湯的最佳提取方法。方法：以RP-HPLC法測(cè)定SBE法、AE法制備的相對(duì)分子質(zhì)量小于等于1000的黃連解毒湯提取液的指紋圖譜。結(jié)果： SBE法制備的黃連解毒湯提取液的結(jié)果大于AE法制備的黃連解毒湯提取液的結(jié)果。結(jié)論：SBE法制備的相對(duì)分子質(zhì)量小于等于1000的黃連解毒湯提取液中的成分最多。

關(guān)鍵詞：SBE法；AE法；黃連解毒湯；提取液；指紋圖譜

【中圖分類號(hào)】

R195 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B 【文章編號(hào)】1002-3763（2014）08-0269-02

黃連解毒湯出自《外臺(tái)秘要》，組方由黃柏、黃芩、黃連、梔子組成，有瀉火、解毒、清熱之功效^[1]。經(jīng)現(xiàn)代研究證實(shí)，其藥理活性具有抗炎、抑菌、抗腦缺血缺氧、抗氧化、提高免疫力等主要作用^[2]。本文旨在比較分析SBE法（半仿生提取法）、AE法（醇提取法）制備的黃連解毒湯提取液的指紋圖譜，以驗(yàn)證黃連解毒湯的最佳提取方法，具體報(bào)告如下：

1 儀器與試藥

1.1 儀器：電子分析天平（MA110型），精密pH計(jì)（pHS-3C型），高效液相色譜儀（Waters-2695），紫外分析儀（UV3010型），醫(yī)用超聲波清洗器（KQ-250E型），中空纖維超濾膜（DH-系列）。

1.2 試藥：黃柏飲片、黃芩飲片、黃連飲片，梔子飲片，梔子苷、黃芩素、鹽酸小檗堿（中國(guó)生物制品研究所），甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、超純水，三氯甲烷（分析純）。

2 方法

2.1 樣品液制備方法：SBE液制備方法：按照處方的比例精確稱取100g方藥粗粉（10目-20目），按照SBE法的提取工藝及藥材組合方式（黃柏和黃芩合煎，黃連和梔子合煎，然后合并煎液），再分別浸泡30分鐘，分別以SBE法進(jìn)行3次提取，加水量按照藥量的10倍、8倍、8倍添加，3煎的pH值分別為2.0、7.0和9.0，提取時(shí)間分別為2小時(shí)、1.5小時(shí)、1.5小時(shí)，然后將3煎的提取液過濾、離心，以中空纖維超濾膜（相對(duì)分子質(zhì)量=1000）濾過、濃縮、合并，將提取液定容到500ml，得到相對(duì)分子質(zhì)量小于等于1000的黃連解毒湯提取液（含有200g/L生物藥）。

AE液制備方法：按照SBE液制備方法，以乙醇（60﹪）為作溶劑，按照上述方法得到相對(duì)分子質(zhì)量小于等于1000的黃連解毒湯提取液（含有200g/L生物藥）。

2.2 供試品溶液制備方法：精確稱取2種樣品液各10ml，置于蒸發(fā)皿內(nèi)，水浴中蒸發(fā)濃縮至近干，加0.8g硅藻土，拌勻、蒸干、研勻，置于磨口三角瓶（100ml）內(nèi)，加入25ml甲醇溶解，稱定質(zhì)量，進(jìn)行30分鐘超聲提取，補(bǔ)足減失質(zhì)量，以布氏漏斗將殘存硅藻土濾除。精密吸取2種濾液各2.5ml，以甲醇定容到10ml，即得到2種供試品溶液（含有20g/L生藥）^[3]。

2.3 對(duì)照品溶液制備方法：精確稱取5.10mg梔子苷對(duì)照品，2.32mg小檗堿對(duì)照品，1.96mg黃芩素對(duì)照品，以甲醇定容到10ml，即得。

2.4 色譜條件：PLATISIT C18-色譜柱（25cm*0.46cm，5m）；流動(dòng)相A：0.1﹪磷酸和0.02 moL/L磷酸二氫鉀。流動(dòng)相B：乙腈；流速：0.8ml/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：225nm；進(jìn)樣量：20ul。

梯度洗脫

3 方法學(xué)考察

3.1 精密度：取供試品SBE溶液，連續(xù)進(jìn)5針，得指紋圖譜，計(jì)算各峰的保留時(shí)間RSD及峰面積RSD。

3.2 重現(xiàn)性：取樣品溶液和供試品溶液5份，進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算各峰的保留時(shí)間RSD及峰面積RSD。

3.3 穩(wěn)定性：取供試品SBE溶液，分別在0H，2H，6H，12H，24H進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算各峰的保留時(shí)間RSD及峰面積RSD。

4 結(jié)果

4.1 方法學(xué)考察中的精密度、重現(xiàn)性及穩(wěn)定性均滿足要求。各峰Rt（相對(duì)保留時(shí)間）的RSD<1.0%，各峰相對(duì)峰面積RSD<5.0%，溶液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

4.2 特征峰，SBE法制備的黃連解毒湯提取液存在23個(gè)特征峰，AE法制備的黃連解毒湯提取液缺少5個(gè)特征峰。

4.3 重疊率，特征峰相似度以?shī)A角余弦法計(jì)算，結(jié)果SBE法制備的黃連解毒湯提取液的結(jié)果大于AE法制備的黃連解毒湯提取液的結(jié)果，這和共有特征峰的重疊率計(jì)算結(jié)果相符。

4.3 峰面積，比較鹽酸小檗堿、黃芩素、梔子苷的指標(biāo)成分、共有特征峰的總面積，結(jié)果SBE法制備的黃連解毒湯提取液的結(jié)果大于AE法制備的黃連解毒湯提取液的結(jié)果。

3 討論

相關(guān)研究顯示，對(duì)380多種常用中藥的活性成分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多數(shù)中藥的相對(duì)分子質(zhì)量在1000以下，這符合“中藥活性成分分子量表”的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，所以本研究以相對(duì)分子質(zhì)量小于等于1000的提取液測(cè)定指紋圖譜，是中藥整體、客觀、模糊、綜合的特點(diǎn)予以體現(xiàn)，為研究現(xiàn)代藥物的新劑型提供有效的技術(shù)支持，為提取中藥未知物質(zhì)拓展思路^[4]。SBE法（半仿生提取法）是依據(jù)中藥及方劑中的部分已知成分，結(jié)合整體的藥物研究方法和分子藥物的研究方法，從生物藥劑學(xué)的角度，對(duì)口服給藥、藥物胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)過程進(jìn)行模擬，為中藥制劑（經(jīng)消化道給藥）設(shè)計(jì)出新的提取技術(shù)。該方法的提取工藝重視有成分論和藥效學(xué)反應(yīng)，綜合評(píng)價(jià)總浸出物、有效成分、不同極性部分的指標(biāo)及藥理作用，對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)選，重視綜合成分作用。本研究顯示，SBE法在提高有效成分提取率、藥學(xué)指標(biāo)方面優(yōu)于AE法。

綜上所述，SBE法制備的相對(duì)分子質(zhì)量小于等于1000的黃連解毒湯提取液中的成分最多。

參考文獻(xiàn)

[1]陳麗靜，孫秀梅，張兆旺，等.3種方法制備的黃連解毒湯提取液指紋圖譜比較[J].中草藥，2013，43（3）：487-491.

[2]彭娟，郭娜，范斌，等.黃連解毒湯高效液相色譜指紋圖譜研究及指標(biāo)成分的含量測(cè)定[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（10）：67-70.

[3]沈嘉，曹現(xiàn)峰，劉九飛.幾種黃連解毒湯的HPLC指紋圖譜研究[J].中成藥，2003，25（6）：434.

[4]竇錦明，孫秀梅，張兆旺，等.黃連解毒湯方藥3種方法提取液成分比較[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21（6）：1369-1371.