苯酚硫酸法測定黃芪中多糖含量

摘要：

目的：采用苯酚硫酸法測定黃芪多糖含量的方法及效果評價。方法：運(yùn)用苯酚硫酸法評價黃芪多糖測定的重復(fù)性、穩(wěn)定性和回收率。結(jié)果：該方法重復(fù)性強(qiáng)，RSD為2.53%；穩(wěn)定性好，在顯色反應(yīng)可維持4h以上，RSD為3.3%；回收率高，RSD為1.78%。黃芪中多糖的含量為59.8%。結(jié)論：本法具有省時省力、重復(fù)性強(qiáng)、穩(wěn)定性好和回收率高等優(yōu)勢，適用于黃芪多糖的含量測定。

關(guān)鍵詞：苯酚硫酸法；黃芪；多糖含量；測定

【中圖分類號】

R97 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】B 【文章編號】1002-3763（2014）08-0014-01

黃芪為豆科紫云屬膜莢黃芪（Astragalus membranceus Fisch Bge）或蒙古黃芪（Amongholicus Bge）的干燥根，作為臨床常用的一種中藥，其不僅在補(bǔ)氣固表、生津養(yǎng)血、利尿消腫、托毒排膿等方面具有良好的功效，還被廣泛應(yīng)用于獸藥及動物飼料添加劑中^[1]。研究表明，黃芪中含有皂苷、黃酮、多糖、氨基酸等多種成分，其中黃芪多糖（Astragalus Polysaccharides， APS）是黃芪主要活性成分之一。大量研究表明，APS具有促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗輻射、抗衰老、抗寄生蟲等多種生物活性，且因其毒副作用小、無殘留、不產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點已被廣泛應(yīng)用于免疫增強(qiáng)劑和抗病毒藥物中^[2]。本文運(yùn)用苯酚硫酸法對黃芪中的多糖含量進(jìn)行測定，評價其重復(fù)性、穩(wěn)定性和回收率等。

1 儀器與藥品

UV751GD 紫外分光光度計（上海精科儀器有限公司）、HZT精密天平（美國華志公司）；無水葡萄糖標(biāo)品（大連美侖有限公司）、黃芪（產(chǎn)自內(nèi)蒙）、硫酸鋅、亞鐵氰化鉀、苯酚、硫酸等試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芪多糖的提取：

先取出黃芪飲片100g，加入10倍量水，然后煮沸50min再過濾，所濾藥渣再加8倍量水煮沸50min后重復(fù)過濾，合并兩次的濾液進(jìn)行濃縮。加95%乙醇至醇濃度為70%后于冰箱中靜置過夜，次日傾去上清液過濾。加同沉淀物量的蒸餾水溶解后重復(fù)上述操作，減壓干燥即得黃芪多糖。

2.2 試劑與溶液配制

2.2.1 5%苯酚水溶液的配制：精密量取苯酚5g，加蒸餾水定容至100mL。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制：精密稱取干燥至恒重的無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.1002g于100mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至容量刻度，混勻后再做10倍稀釋備用。

2.2.3 黃芪多糖溶液的制備： 準(zhǔn)確稱取黃芪多糖1.0g置于250mL容量瓶，加蒸餾水50mL后微微加熱，待多糖溶解冷卻后加入5mL 30%的硫酸鋅溶液，水浴加熱5min后一邊晃動一邊迅速加入5mL亞鐵氰化鉀溶液，再次冷卻后加蒸餾水至容量刻度，混合均勻進(jìn)行重復(fù)過濾，取二次濾液25mL于500mL容量瓶中，加蒸餾水至容量刻度混勻備用。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

分別量取0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液于10mL容量瓶中，依次加入0.5mL 5%苯酚溶液和5mL98%濃硫酸溶液，混合均勻后于沸水浴中加熱20min，冷卻后加蒸餾水至容量刻度。用UV751GD 紫外分光光度計在490nm處以空白為參照分別測定吸光度值。結(jié)果見下表1。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得出回歸方程為A=0.012C+0.019，r=0.9993，在5～25μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.4 黃芪中多糖含量的測定：

準(zhǔn)確量取2mL黃芪多糖溶液置10mL容量瓶中，依次加入0.5mL 5%苯酚溶液、5mL 98%硫酸，混合均勻后置沸水中20min，冷卻稀釋后于490nm處測定吸光度值，根據(jù)2.2得出的回歸方程計算得出受試黃芪中多糖的含量為59.8%。

2.5 重復(fù)性檢測：

平行稱取上述黃芪多糖溶液6份，按2.3所述方法進(jìn)行重復(fù)測定。6份樣品的黃芪多糖含量分別為：59.4%、60.0%、59.8%、59.5%、60.1%、59.6%，計算平均含量為59.7%，RSD為2.53%。

2.6 穩(wěn)定性檢測：

分別在0、1、2、4、8h下對受試黃芪進(jìn)行吸光度測定，結(jié)果證明該受試黃芪溶液在8h內(nèi)基本保持穩(wěn)定，其中0～4h內(nèi)表現(xiàn)為很穩(wěn)定，4h后呈現(xiàn)下降趨勢，RSD=3.3%。

2.7 回收率檢測：

取6份已知含量的黃芪多糖樣品通過添加不同量的葡萄糖進(jìn)行回收率檢測。計算平均回收率為99.2%，RSD為1.78%，具體結(jié)果見下表2。

3 討論

黃芪多糖含量的測定方法主要有苯酚硫酸法、蒽酮濃硫酸法、DDS法（3，5-二硝基水楊酸法）以及碘量法^[3]。苯酚-硫酸法主要用于甲基化糖、戊糖和多聚糖的測定，且基本不受蛋白質(zhì)存在的影響；蒽酮濃硫酸法適用于糖的微量測定，試劑簡單，操作簡便；DDS法為半微量定糖法，操作簡便、快速且較少受其他雜質(zhì)的干擾；碘量法雖具有干擾小、準(zhǔn)確度高的特點，但較苯酚硫酸法操作繁瑣。目前黃芪多糖含量的測定多運(yùn)用苯酚硫酸法，其原理是：多糖在濃硫酸作用下能夠水解生成單糖，單糖迅速脫水生成糖醛衍生物后與苯酚縮合可生成一種橙黃色的化合物，該化合物顏色穩(wěn)定且在波長490nm處有最大的吸收值，其吸光度與總糖含量成線性關(guān)系^[4]。

本文運(yùn)用苯酚硫酸法進(jìn)行黃芪中多糖含量的測定，結(jié)果證明其重復(fù)性強(qiáng)，RSD為2.53%；穩(wěn)定性好，在顯色反應(yīng)可維持4h以上，RSD=3.3%；回收率高，RSD為1.78%，又因該測定方法操作簡單，試劑便宜，故是測定黃芪多糖含量的首選方法。但值得注意的是，黃芪多糖為中藥提取物，它的純度受很多因素的制約，以致影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性^[5]，且該方法只能測出黃芪多糖中總糖的含量，而不能分組分測定單糖及多糖的含量^[6]。

參考文獻(xiàn)

[1]朱振元，劉榮強(qiáng)，周芳，等.黃芪多糖的分離純化和抗腫瘤活性研究[J].現(xiàn)代食品科技，2011，27（4）：376-379.

[2]張彥麗，合力力阿布都熱合曼，斯馬義阿依吐倫.苯酚-硫酸法測定維吾爾藥昆侖雪菊多糖含量的研究[J].藥物分析雜志，2010（011）：2205-2207.

[3]于曉輝，劉自揚(yáng)，楊勁松，等.薄層色譜法與苯酚硫酸法聯(lián)用控制黃芪多糖粗粉質(zhì)量[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（14）：7312-7314.

[4]涂波，汪志勇.當(dāng)歸補(bǔ)血湯顆粒中黃芪甲苷和黃芪多糖的含量測定[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，17（18）：115-117.

[5]付娟，張海弢，楊世海，等.不同產(chǎn)地黃芪多糖含量的測定[J].人參研究，2013，25（002）：28-30.

[6]金芬芬，金錫姣，楊惠鑫，等.不同提取方法對黃芪多糖提取率影響的實驗研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2013，31（10）：2136-2138.