HPLC測定固腎定喘丸中丹皮酚的含量

摘要：目的： 通過測定固腎定喘丸中丹皮酚的含量對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行控制； 方法： 采用高效液相色譜法（HighPerformanceLiquidChromatography，HPL-C），選用XDBC-18076331柱（250mm×4.6mm，10μm，），甲醇-水（45：55）為流動(dòng)相；柱溫：25℃，流速為1.0ml·min-1；測定波長為274nm；進(jìn)樣量：10μL。 結(jié)果： 丹皮酚在4.312-107.800μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（A=203.29X+2.74，r=1.0000），平均回收率為99.06%，RSD=0.28%； 結(jié)論： 該方法簡便、靈敏、準(zhǔn)確，可用于固腎定喘丸的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞： HPLC；固腎定喘丸；丹皮酚

【中圖分類號(hào)】R286.0 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1002-3763（2014）04-0059-01

1.儀器與試藥

Agilent1200全自動(dòng)高效液相色譜儀，Agilent1200系列四元泵，AgilentG1314BVWD1200系列可變波長紫外檢測器，Agilent1200化學(xué)工作站；KQ-電子分析天平（瑞士METTLERTOLEDO，型號(hào)：XS105）。KQ-600DE型數(shù)控超聲波清洗器甲醇為分析純；水為去離子水。對(duì)照品：丹皮酚對(duì)照品 固腎定喘丸由廣州白云山敬修堂藥業(yè)股份有限公司提供

2.方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱為Hypersil-C18柱（250mm×4.6mm，10μm，特），甲醇-水（45：55）為流動(dòng)相，流速為1.0ml·min-1，檢測波長274nm，柱溫為室溫。理論塔板數(shù)應(yīng)不低于5000，此條件下待測組分與其它組分達(dá)到有效分離。

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備

精密稱取丹皮酚對(duì)照品1mg，置于50ml的容量瓶中，加入甲醇至刻度，作為貯備液，即得。

2.2.2供試品溶液的制備

精密量取本品0.5g，置于50mL燒瓶里，精確加入甲醇25，用天平稱出重量，利用超聲波處理30min，放冷，再確定重量，根據(jù)溶液的減少量補(bǔ)足甲醇，再搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即可配制出供試品溶液。

2.2.3陰性對(duì)照溶液的制備

陰性對(duì)照溶液的制備是按照中藥的處方中各種中藥的味數(shù)的比例確定的，按其工藝，制成不含牡丹皮的空白制劑，制備方法和供試品溶液的制備方法相同。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1線性范圍考察

精密吸取丹皮酚2、4、6、8、10、12μl的對(duì)照品溶液進(jìn)行色譜測定，按“2.1”項(xiàng)所述色譜條件分別測定峰面積。按照橫坐標(biāo)為進(jìn)樣量X（μl），縱坐標(biāo)為峰面積（mAUS）的參數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程。丹皮酚的回歸方程是：A=203.29X+2.74，相關(guān)系數(shù)r=1.0000。丹皮酚在4.312-107.800μg范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系。

2.3.2精密度試驗(yàn)

精密吸取（20.58μg.ml-1）10μl的丹皮酚對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，測得連翹苷峰面積的平均值為2006.1，RSD為0.69%。

2.3.3穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液分別于0、2、4、8、24h進(jìn)樣10μl，測定峰面積的平均值為446.3，RSD為0.3%，其結(jié)果顯示丹皮酚24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)（批號(hào)：L01003）固腎定喘丸按供試品溶液制備方法制備5

份供試樣品，每份測定2次，測得丹皮酚的平均含量為103.60μg.ml-1，RSD為1.1%。

2.3.5回收率試驗(yàn)

精密吸取已知含量的固腎定喘丸樣品（批號(hào)：L01003）1ml，分別精密加入10ml丹皮酚對(duì)照品貯備液，按供試品溶液制備方法制成加樣供試品溶液，吸取加樣供試品溶液10μl注入液相色譜儀。按上述方法測定加樣供試品溶液中丹皮酚的含量平行操作6份，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測定含量，分別計(jì)算回收率。2.4樣品測定

精密量取丹皮酚對(duì)照溶液10μl，供試品溶液10μl分別注入液相色譜儀中，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，計(jì)算丹皮酚含量。

3.討論

3.1有效成分

丹皮酚是中藥牡丹皮的有效成分，而且含量較高，故以其為指標(biāo)，測定其在制劑中的含量，以此來控制固腎定喘丸的質(zhì)量。

3.2波長的選擇

最佳檢測波長的選擇經(jīng)查閱文獻(xiàn)，丹皮酚對(duì)照品溶液在274nm波長處有最大吸收，中國藥典2010年版一部牡丹皮含量測定選用274nm作為檢測波長[1]，因此實(shí)驗(yàn)選擇274

nm作為檢測波長。

3.3流動(dòng)相的選擇

通過查閱文獻(xiàn)[2-10]，發(fā)現(xiàn)曾有人采用：乙腈-1%冰乙酸系統(tǒng)、乙腈-水系統(tǒng)、甲醇-乙酸-水系統(tǒng)，通過參照文獻(xiàn)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)采用甲醇-水（45：55）時(shí)，丹皮酚峰形對(duì)稱，分離完全，雜質(zhì)干擾少，基線平直，故采用甲醇-水（45：55）作為流動(dòng)相。

3.4提取方法

牡丹皮超聲提取時(shí)間的選擇本文選用超聲方法提取牡丹皮中丹皮酚，方法簡便易行，經(jīng)比較不同超聲提取時(shí)間結(jié)果表明超聲振蕩30min，丹皮酚己基本提盡。

3.5峰形

在實(shí)驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)有的峰形不是很好，比如出現(xiàn)肩峰、峰拖尾或出現(xiàn)基線噪聲，分析其各自原因及各自的解決方法：（1）出現(xiàn)肩峰可能的原因及解決方法有：①柱塌陷或形成短路通道：更換色譜柱，采用較弱腐蝕性條件；②柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效：更換燒結(jié)不銹鋼。（2）出現(xiàn)峰拖尾可能的原因及解決方法有：①峰干擾：清潔樣品，調(diào)整流動(dòng)相；②硅羥基作用：加三乙胺，用堿致鈍化柱，增加緩沖液或鹽的濃度降低流動(dòng)相pH值，鈍化樣品；③柱效下降：用較低腐蝕條件，更換柱，采用保護(hù)柱。（3）出現(xiàn)基線噪聲的原因及解決方法有：①氣泡：流動(dòng)相脫氣，加柱后背壓；②.污染：清洗柱，凈化樣品，用HPLC級(jí)試劑。

結(jié)束語

由于中藥成分比較復(fù)雜，使用高效液相色譜分析法作為其質(zhì)量控制的主要方法，這種測量方法分離效果好，分析速度快，靈敏度高，操作自動(dòng)化，是對(duì)中藥進(jìn)行成分分析的一種極有價(jià)值的分析技術(shù)。實(shí)驗(yàn)中也可以體驗(yàn)到方法的優(yōu)勢(shì)。采用高效液相色譜法，可以為固腎定喘丸的質(zhì)量控制提供了快速、準(zhǔn)確的測定方法。

參考文獻(xiàn)：

[1]國家藥典委員會(huì)，中華人民共和國藥典[S].一部，北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：160-161

[2]賈瑞艷，劉影.HPLC法測定六味地黃丸（濃縮丸）中丹皮酚的含量[J].黑龍江醫(yī)藥，2009，22（2）：120-122

[3]寇婉青，開偉華，王蓉，等.HPLC法測定桂枝茯苓丸中丹皮酚的含量[J].安徽醫(yī)藥，2009，13（5）：508-509