一株淡紫紫孢菌的分離、鑒定及生物學(xué)特性研究

柯心如，劉登艷，譚建彬，蘇 琦，李 亞

（廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 湛江 524088）

【研究意義】植物寄生線蟲是植物侵染性病害的主要病原物之一，每年給世界各地的主要經(jīng)濟作物造成高達1 570 億美元損失，其中根結(jié)線蟲（Meloidogynespp.）是為害最嚴重的植物寄生線蟲，由于其分布廣泛、寄主眾多，已成為威脅農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要病原［1］。目前對根結(jié)線蟲的防治主要以化學(xué)藥劑防治為主，但該防治方法生產(chǎn)成本較高，對環(huán)境造成污染，同時也對人畜健康存在潛在威脅［2］。而生防制劑作為一種環(huán)境友好的化學(xué)藥劑替代品逐漸引起人們的重視，可通過充分利用線蟲天敵的生防手段來防治植物線蟲。而淡紫紫孢菌（Purpureocillium lilacinum）能有效防治根結(jié)線蟲，是一種極具推廣潛力的習居菌和功能菌［3-4］。研究表明，淡紫紫孢菌可用于防治馬鈴薯、番茄、小麥及香蕉等幾十種經(jīng)濟作物的線蟲病，且防效與進口的化學(xué)殺線蟲藥相當或接近，成本較低，不污染農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境［5-8］。因此，探究不同培養(yǎng)條件對淡紫紫孢菌生長特性的影響，對充分挖掘該菌的生防潛能具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】淡紫紫孢菌原名為淡紫擬青霉（Paecilomyces lilacinus），最初由Jatala 于1979 年在南方根結(jié)線蟲卵中分離獲得［9-10］。該菌能通過分泌菌絲寄生根結(jié)線蟲的蟲卵或通過分泌幾丁質(zhì)酶和絲氨酸蛋白酶降解線蟲表皮的幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì)成分，從而入侵并破壞細胞成分，對根結(jié)線蟲幼蟲具有毒殺作用［11］。然而，國內(nèi)外對擬青霉屬真菌研究較少，對抗線蟲的防治主要集中在侵染機制等方面。楊凡等［12］測定了淡紫紫孢菌pt361 對黃瓜根結(jié)線蟲卵的寄生率、幼蟲致死率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pt361 菌株對線蟲蟲卵的寄生率為72.6%，其菌株混合發(fā)酵液對幼蟲的致死率達95.2%。Gine 等［6］研究抗性番茄與淡紫紫孢菌PI251 菌株組合對抗南方根結(jié)線蟲的有效性，結(jié)果表明該菌在體外條件下可寄生94.5%根結(jié)線蟲的蟲卵。同時，也有部分學(xué)者對該菌的生長特性等進行研究，例如，范瑞琦等［13］從為害海南省茄子根結(jié)線蟲雌蟲體內(nèi)分離的淡紫紫孢菌最適培養(yǎng)基為PDA，最佳生長溫度和產(chǎn)孢溫度均為28℃，最適pH 為7.0，完全黑暗條件更有利于菌株生長、產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)?！颈狙芯壳腥朦c】目前，大多數(shù)研究主要集中于淡紫紫孢菌與根結(jié)線蟲的互作機制及該菌生長特性等方面，但針對不同環(huán)境對淡紫紫孢菌發(fā)酵所產(chǎn)蛋白酶、幾丁質(zhì)酶的相關(guān)研究報道極少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】確定適合淡紫紫孢菌生長、產(chǎn)蛋白酶和幾丁質(zhì)酶的最適溫度和pH 值，以及常見氮源和碳源物質(zhì)，幫助菌株建立最佳生長和收獲條件，以達到最大生防活性，為該菌大量繁殖作為生物防治劑的后續(xù)研究及應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為具有柑橘粉虱座殼孢子座的紅江橙樹葉片，于2017 年12 月份采集自廣東廉江紅江農(nóng)場的橙樹果園。

供試培養(yǎng)基：（1）PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、瓊脂粉20 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 000 mL；（2）PDA 液體培養(yǎng)基以不加瓊脂配置。上述培養(yǎng)基均于121℃高壓滅菌20 min 后備用。

主要試劑：細菌基因組DNA 快速抽提試劑盒、擴增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 菌株分離純化

將柑橘粉虱座殼孢子座用無菌水沖洗后，經(jīng)75%乙醇浸泡30 s，轉(zhuǎn)入0.1%升汞溶液中浸泡30 s，然后用無菌水清洗3～5 次。把表面消毒好的子座研磨后放入1.5 mL 離心管中，加入1 mL無菌水制成孢子懸浮液，取100 μL 接種于含有利福平的PDA 培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)。待長出菌絲或菌落后，挑取具有典型菌落特征的單菌落進行純化，獲得編號為ZJPL1812 的菌株，將純化后的菌株接種于試管斜面，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 菌株鑒定

1.3.1 形態(tài)鑒定 從純化ZJPL1812 菌株的單菌落中取直徑0.5 cm 的菌餅接于PDA 平板中央，培養(yǎng)7 d 后觀察菌落外觀特征，并通過光學(xué)顯微鏡觀察菌絲、分生孢子梗以及分生孢子的形態(tài)特征，參照《真菌鑒定手冊》［14］進行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.3.2 分子鑒定 參照White 等［15］設(shè)計的通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGT-GAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCT-TATTGATATGC-3′）進行真菌的rDNA-ITS 序列擴增。PCR 反應(yīng)體系共50 μL，反應(yīng)條件為：96℃預(yù)變性5 min；95℃變性45 s、55℃復(fù)性30 s、72℃延伸60 s，35 個循環(huán)；72℃延伸7 min。PCR 完成后取5 μL 產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓120 V，電泳25 min，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察目的條帶。將目的條帶的PCR 產(chǎn)物送至英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測序。利用NCBI Blast 進行序列比對，并采用MEGA11 通過Neighbor-Joining 算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 菌株生物學(xué)特性研究

1.4.1 不同培養(yǎng)條件對菌株生長的影響 供試菌株在PDA 平板上培養(yǎng)7 d 后，加入10 mL 無菌水，刮取孢子絲和孢子制成菌懸液，用雙層紗布過濾制成孢子懸浮液，將孢子懸浮液濃度調(diào)整至1×109個/mL 備用。

（1）溫度：將1 mL 孢子懸浮液加入100 mL PDA 液體培養(yǎng)基中，分別在10、15、20、25、30、35℃條件下避光振蕩（180 r/min）培養(yǎng)，每個處理3 次重復(fù)。

（2）pH 值：用0.1 mol/L HCl 和NaOH 溶液將100 mL PDA液體培養(yǎng)基pH值調(diào)至3.0、5.0、7.0、9.0、11.0，隨后分別加入孢子懸浮液1 mL，30℃下避光振蕩（180 r/min）培養(yǎng)，每個處理3 次重復(fù)。

（3）氮源：以PDA 液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加5 g/L 的硝酸銨、硝酸鈉、精氨酸和磷酸二氫銨，配制成不同氮源的培養(yǎng)基。隨后在各類型氮源培養(yǎng)基中分別加入孢子懸浮液1 mL，30℃下避光振蕩（180 r/min）培養(yǎng)，每個處理3 次重復(fù)。

（4）碳源：以PDA 液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以20 g/L 的蔗糖、麥芽糖、山梨醇和可溶性淀粉代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，配制不同碳源的培養(yǎng)基。隨后在各類型碳源培養(yǎng)基中分別加入孢子懸浮液1 mL，30℃下避光振蕩（180 r/min）培養(yǎng)，每個處理3 次重復(fù)。

待測菌株在不同類 型培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d 后，將培養(yǎng)液于8 000 r/min 下離心20 min，過濾收集菌絲體，于60℃下干燥至恒重，并稱重。

1.4.2 不同培養(yǎng)條件對菌株蛋白酶活性的影響 待測菌株在1.4.1 不同類型培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d后，將培養(yǎng)液于8 000 r/min 下離心20 min，除去菌體取上清，其中的蛋白酶用(NH4)2SO4沉淀后再經(jīng)透析袋透析獲得粗酶液［16］。

標準曲線參照張龍翔等［17］的方法制作，蛋白酶活性的測定采用Folin-酚法［18］。測得的吸光值（OD）通過標準曲線計算出相應(yīng)的酪氨酸濃度，根據(jù)公式計算出酶活。以每毫升樣品在40℃下每分鐘催化分解酪蛋白生成1 μg 酪氨酸的酶量為一個酶活力單位（U）。

蛋白酶活力（U/mL）=K1×△A680×N×4/10

式中，K1 為根據(jù)標準曲線求得光密度為1 時對應(yīng)的酪氨酸濃度；△A680 為OD680樣品-OD680對照；N 為酶液稀釋倍數(shù)；4 表示2 mL 反應(yīng)液中取0.5 mL 進行顯色反應(yīng)；10 表示反應(yīng)時間為10 min。

1.4.3 不同培養(yǎng)條件對菌株幾丁質(zhì)酶活性的影響 待測菌株在1.4.1 不同類型培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d 后，將培養(yǎng)液于8 000 r/min 下離心20 min，除去菌體取上清，經(jīng)0.45 μm 的混合纖維素膜過濾后制成粗酶液。

標準曲線參照鄧彩萍等［19］的方法制作，幾丁質(zhì)酶活性的測定采用DNS（3,5-二硝基水揚酸）法［20］。測得的OD 值通過標準曲線計算出相應(yīng)的NAG（N-乙酰氨基葡萄糖）濃度，根據(jù)公式計算出酶活。以每毫升發(fā)酵液每分鐘水解脫乙酰膠體幾丁質(zhì)產(chǎn)生1 μg NAG 的酶量為一個酶活力單位（U）。

幾丁質(zhì)酶活力（U/mL）＝K2×△A530×N×2/60

式中，K2 為根據(jù)標準曲線求得光密度為1 時對應(yīng)的NAG 濃度；△A530 為OD530樣品-OD530對照；N 為酶液稀釋倍數(shù)；2 表示1 mL 反應(yīng)液中取0.5 mL 進行顯色反應(yīng)；60 表示反應(yīng)時間為60 min。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0 軟件中的方差分析（ANOVA）和Duncan’s新復(fù)極差法分析差異顯著性，運用GraphPad Prism 9.0 進行數(shù)據(jù)處理和圖片繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株ZJPL1812 的分離和純化

從廣東廉江紅江農(nóng)場采集的柑橘粉虱座殼孢子座如圖1 所示，肉質(zhì)子座多位于柑橘葉片背面，成熟的子座中間為橙黃色，邊緣呈黃色，與葉片連接處可見白色菌絲，子座中間乳突狀隆起，其中有多個不規(guī)則孔口，可分泌蜜汁或膠質(zhì)，從該子座中分離純化得到ZJPL1812 菌株。

圖1 柑橘粉虱座殼孢子座和純化的ZJPL1812 菌落形態(tài)Fig.1 Stroma of Aschersonia aleyrodis and colonies morphology of purified ZJPL1812

2.2 菌株ZJPL1812 的鑒定結(jié)果

2.2.1 形態(tài)學(xué)特征 菌株ZJPL1812 在PDA 固體培養(yǎng)基上，初期菌絲白色、致密，表面無分泌物，菌落形態(tài)有同心輪紋狀（圖2A），也有呈分散狀態(tài)的絨毛狀（圖2B），隨著培養(yǎng)時間的延長，菌落中心由淡紫色逐漸變?yōu)榛液谏▓D2C）。

圖2 菌株ZJPL1812 的菌落形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of colonies of strain ZJPL1812

該菌株菌絲狹長、無色、具分隔，產(chǎn)孢方式為內(nèi)壁芽生瓶梗式（圖3A），瓶?；坑忻黠@膨大，頂端逐漸變細（圖3B、圖3C），分生孢子梗頂端多次輪生燒瓶狀產(chǎn)孢瓶梗，頂生分生孢子，分生孢子透明、串生，單個孢子橢圓形或近圓形、大小為2.5～3.2 μm×2.0～2.2 μm（圖3D）。

圖3 菌株ZJPL1812 的形態(tài)特征Fig.3 Morphological characteristics of strain ZJPL1812

2.2.2 分子鑒定 利用通用引物ITS1 和ITS4 對分離得到的ZJPL1812 菌株DNA 進行擴增，經(jīng)電泳分析獲得1 條約500 bp 的條帶（圖4）。經(jīng)序列測定，片段大小為376 bp。將ZJPL1812菌株的ITS 序列在NCBI 中進行Blast 比對分析，結(jié)果顯示該菌株與GenBank 中多個淡紫紫孢菌菌株（Purpureocillium lilacinum，登錄號：MH483735.1、MH483859.1、MH483660.1）的 同源性為99%～100%。通過MEGA11 軟件進行相關(guān)分析并構(gòu)建系 統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明ZJPL1812菌株與多個淡紫紫孢菌（P.lilacinum）聚在一支（圖5），結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，將ZJPL1812 菌株鑒定為淡紫紫孢菌（P.lilacinum）。

圖4 菌株ZJPL1812 ITS 區(qū)PCR 擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.4 Electrophoretogram of PCR amplification results in ITS region of strain ZJPL1812

圖5 基于rDNA-ITS 序列構(gòu)建的菌株ZJPL1812 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of strain ZJPL1812 constructed based on rDNA-ITS sequence

2.3 不同培養(yǎng)條件對菌株ZJPL1812 生物量的影響

溫度對菌株ZJPL1812 的生物量積累具有顯著影響，不同溫度處理間差異顯著（圖6A），當溫度為10℃時菌絲幾乎不生長，15～35℃范圍內(nèi)菌絲均能生長，但在15、35℃條件下菌絲生長受到明顯抑制，30℃時菌絲干質(zhì)量最大、達到3.4 g/L?？梢姡摼曜钸m培養(yǎng)溫度為30℃，該溫度下的菌株生長情況與其他培養(yǎng)溫度相比均達到顯著差異。不同pH 值對該菌株生長的影響結(jié)果（圖6B）表明，該菌株能耐受較廣的酸堿度范圍，在pH 5.0～9.0 范圍內(nèi)均生長良好，各處理間菌絲體干質(zhì)量無顯著差異，在pH 3.0 和pH 11.0 條件下生長相對較差、生物量積累較少。該菌株在供試的7 種不同氮源培養(yǎng)基上生長狀態(tài)不同（圖6C），對不同氮源培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d 后的菌絲體干質(zhì)量測定結(jié)果顯示，以硫酸銨、磷酸二氫銨為氮源的培養(yǎng)基菌絲體干質(zhì)量最大，分別可達1.585、1.667 g/L，但二者之間無顯著差異；隨后依次為蛋白胨、精氨酸和硝酸胺，菌絲體干質(zhì)量分別為0.965、0.697、0.667 g/L；以硝酸鈉為氮源和無氮源條件下菌絲生長較弱，表明以硫酸銨、磷酸二氫銨為氮源比較適合該菌株生長。不同碳源培養(yǎng)基對該菌株的生物量積累差異顯著（圖6D），其中在以麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基上長勢最好，菌絲體干質(zhì)量最大達3.013 g/L，且與其他供試碳源之間差異顯著；可溶性淀粉和山梨醇次之，菌絲體干質(zhì)量分別為1.673、1.540 g/L；而以蔗糖、葡萄糖為碳源時長勢最差，菌絲體干質(zhì)量低。

圖6 不同培養(yǎng)條件對菌株ZJPL1812 生物量的影響Fig.6 Effects of different culture conditions on the biomass of strain ZJPL1812

2.4 不同培養(yǎng)條件對菌株ZJPL1812 蛋白酶活性的影響

由菌株ZJPL1812 產(chǎn)生的蛋白酶在10～35℃均有活性，最適反應(yīng)溫度為25～30℃，酶活性分別可達0.47、0.63 U/mL，但差異不顯著；當溫度在10～30℃時，蛋白酶活性隨溫度升高而上升、超過30℃迅速下降（圖7A）。在pH 值3.0～11.0 范圍內(nèi)，pH 為5.0、7.0 和9.0 時蛋白酶活性最高，分別為3.556、3.133、2.545 U/mL，三者之間差異不顯著；當培養(yǎng)基pH 過高或過低（pH 為11.0或3.0）時，蛋白酶活性最低，分別為0.467、0.256 U/mL（圖7B）。可見，該菌株在中性、弱酸和弱堿環(huán)境條件下所產(chǎn)生的蛋白酶活性較高。菌株ZJPL1812 產(chǎn)生的蛋白酶在不同氮源培養(yǎng)基上活性不同，以蛋白胨為氮源時酶活性最高，其次為硫酸銨、精氨酸、硝酸鈉、硝酸銨，但在以磷酸二氫銨為氮源時蛋白酶活性極低，與不含氮源的培養(yǎng)基無顯著差異（圖7C）。不同碳 源對ZJPL1812 蛋白酶活性影響結(jié)果表明，以蔗糖為碳源時蛋白酶活性最高，麥芽糖、可溶性淀粉、山梨醇次之，而以葡萄糖作為碳源時長勢最差、酶活性最低（圖7D）。

圖7 不同培養(yǎng)條件對菌株ZJPL1812 蛋白酶活性的影響Fig.7 Effects of different culture conditions on the protease activity of strain ZJPL1812

2.5 不同培養(yǎng)條件對菌株ZJPL1812 幾丁質(zhì)酶活性的影響

在溫度10～30℃范圍內(nèi)，該菌所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活性隨溫度上升逐漸提高，至30℃時達到最大值0.910 U/mL，是10℃時幾丁質(zhì)酶活性的20 倍；隨著溫度上升幾丁質(zhì)酶活性開始下降，35℃時幾丁質(zhì)酶活性僅有30℃時的6 8%（圖8A）?？梢姡h(huán)境溫度小于10℃或高于35℃均會使該菌所產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶活性降低。菌株ZJPL1812 在供試的5 種pH 條件下均有活性（圖8B），pH 5.0～7.0時酶活性較高，在pH 3.0 或pH 9.0～11.0 條件下酶活性較低，與前者具有顯著差異。氮源對ZJPL1812 發(fā)酵產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的結(jié)果表明，以硝酸銨為氮源時產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活性最高（0.230 U/mL），其次是磷酸二氫銨，在蛋白胨、硝酸鈉、精氨酸、硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基中酶活性均較低，其中以硫酸銨效果最差（圖8C），與無氮源培養(yǎng)基無顯著差異。菌株ZJPL1812 在不同碳源培養(yǎng)基上的幾丁質(zhì)酶活性不同（圖8D），在以可溶性淀粉、葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上酶活性最高，且均顯著高于其他碳源處理，在麥芽糖、山梨醇、蔗糖上酶活性較低，三者之間無顯著差異。

圖8 不同培養(yǎng)條件對菌株ZJPL1812 幾丁質(zhì)酶活性的影響Fig.8 Effects of different culture conditions on the chitinase activity of strain ZJPL1812

3 討論

柑橘粉虱座殼孢子座是由柑橘粉虱座殼孢菌（Aschersoni a aleyrodis）侵染柑橘粉虱各齡幼蟲之后形成的。本研究從該子座中除分離到柑橘粉虱座殼孢菌外，還成功分離到菌株ZJPL1812，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子鑒定確認為淡紫紫孢菌，表明在雷州半島除粉虱座殼孢菌外，淡紫紫孢菌也可能對柑橘粉虱的種群控制有著重要貢獻。有研究表明，淡紫紫孢菌孢子可以侵染柑橘木虱成蟲［21］，此外，該菌還廣泛應(yīng)用于防治棉花蚜蟲（Aphis gossypiiGlover）［22］、蘿卜蚜（Lipalus erysimi）［23］、切葉蟻（Acromyrmex）［24］和甘薯粉虱（Bemisia tabaci）［25］等。因此，研究淡紫紫孢菌的適宜生長環(huán)境和營養(yǎng)條件，實現(xiàn)菌株最優(yōu)培養(yǎng)，并大量生產(chǎn)淡紫紫孢菌，對該菌后續(xù)作為生物防治劑的應(yīng)用具有重要意義。

本研究通過對菌株ZJPL1812 生物學(xué)特性的初步研究發(fā)現(xiàn)，該菌在15～35℃條件下均可生長，其中30℃最適合，這與Girardi 等［26］、鄧嘉茹等［27］研究結(jié)果基本一致。同時，發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶（蛋白酶、幾丁質(zhì)酶）影響結(jié)果表明，該菌具有較廣的產(chǎn)酶溫度范圍（10～35℃），以30℃為最適溫度。已報道的淡紫紫孢菌最適產(chǎn)幾丁質(zhì)酶溫度也多在30℃左右［28-29］，少數(shù)菌株需要更高的發(fā)酵溫度（60℃）［30］。綜合前人及本研究結(jié)果可知，該菌所需的生長、產(chǎn)酶溫度范圍較廣，但最佳生長溫度、產(chǎn)酶溫度較窄，因此在實際應(yīng)用中應(yīng)確定適當施用時機，不宜在長時間較高溫或較低溫的季節(jié)施用，以保證菌株活性及防治效果。

本研究顯示菌株ZJPL1812 在pH 5.0～9.0 條件下均可生長，表明該菌能適應(yīng)弱酸性或弱堿性的生長環(huán)境。而根結(jié)線蟲適宜的土壤pH 值為4.0～8.0、生長發(fā)育溫度為20～28℃，與該菌適宜生長環(huán)境條件相吻合。這有利于該菌的田間應(yīng)用，可在一定程度上緩解根結(jié)線蟲病害。

微生物所產(chǎn)蛋白酶、幾丁質(zhì)酶根據(jù)所適應(yīng)的pH 值不同可以分為酸性、中性和堿性，而真菌產(chǎn)蛋白酶、幾丁質(zhì)酶多為酸性蛋白，其蛋白酶反應(yīng)的最適pH 范圍為3.8～5.6，幾丁質(zhì)酶最適pH 范圍為4.0～7.0［31-32］。本試驗中ZJPL1812 發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶、幾丁質(zhì)酶均在pH 值為5.0～9.0 內(nèi)保持穩(wěn)定，且在pH 值5.0 時保持較高活性，屬于酸性蛋白酶和酸性幾丁質(zhì)酶，表明該菌所產(chǎn)酶的pH 值穩(wěn)定范圍較寬、酸堿耐受性很強，適于工業(yè)生產(chǎn)。

此外，有研究表明淡紫擬青霉（即淡紫紫孢菌）能利用多種碳源（單糖、寡糖、多糖）和多種氮源（有機、無機、硝態(tài)氮和氨態(tài)氮），簡單無機物質(zhì)（迅速利用型，如氨態(tài)氮）易于被菌體吸收利用［33］。本試驗在研究培養(yǎng)基碳源、氮源對淡紫紫孢菌生長的影響等方面與已報道的淡紫擬青霉有相似之處，該菌在無機氮源上產(chǎn)生的菌絲干質(zhì)量顯著高于有機氮培養(yǎng)基，但在碳源中對麥芽糖的利用率最佳，這與肖順“選用結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的可溶性淀粉為最適碳源，最利于菌株的液體培養(yǎng)”［34］的研究結(jié)果不同。這可能是由于淡紫紫孢菌為土壤寄生真菌，其生物學(xué)特性與土壤環(huán)境中的多種因素有關(guān)，不同地區(qū)、不同物種所分離得到的菌株生物學(xué)特性存在差異。

除溫度、pH 值條件外，營養(yǎng)成分條件也是影響淡紫紫孢菌發(fā)酵產(chǎn)酶的重要因素之一。不同菌株對氮源的利用和產(chǎn)蛋白酶情況相同，本試驗結(jié)果表明蛋白胨是提高產(chǎn)蛋白酶的有效氮源，這與趙培靜等“蛋白胨對于淡紫擬青霉的蛋白酶高產(chǎn)有促進效果”［35］的結(jié)論相同，表明高分子有機氮對蛋白酶具有誘導(dǎo)作用。但不同菌株對氮源的利用和產(chǎn)幾丁質(zhì)酶情況并不相同，張馨月等［29］采用固體發(fā)酵淡紫紫孢菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶以蛋白胨作氮源時活性達到最高，而本研究所產(chǎn)的幾丁質(zhì)酶以硝酸銨為最佳氮源、以蛋白胨為氮源時活性較低，表明無機氮比有機氮誘導(dǎo)產(chǎn)酶效果更佳。已有報道表明，在淡紫擬青霉產(chǎn)幾丁質(zhì)酶時以殼聚糖作為誘導(dǎo)底物并添加葡萄糖，可使幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量維持在較穩(wěn)定水平，但整體產(chǎn)酶量不高，可能是產(chǎn)生了葡萄糖效應(yīng)。本研究中以葡萄糖為碳源時的淡紫紫孢菌產(chǎn)酶能力在所供試碳源中最佳。

以上研究結(jié)果表明，菌株ZJPL1812 具有較強的環(huán)境適應(yīng)能力和較廣泛的酸堿適應(yīng)能力，同時還可以利用多種氮源和碳源。但自然篩選菌株所產(chǎn)蛋白酶、幾丁質(zhì)酶的能力較低，為進一步提高酶活性、促進淡紫紫孢菌作為生物防治劑商業(yè)化發(fā)展，還需要通過復(fù)合誘變技術(shù)篩選高產(chǎn)菌株，或者通過基因重組技術(shù)進行蛋白酶、幾丁質(zhì)酶基因的序列分析、克隆表達和生產(chǎn)。

4 結(jié)論

本研究通過對紅江橙葉片粉虱座殼孢上的菌株進行分離純化及鑒定，確定菌株ZJPL1812 為淡紫紫孢菌（Purpureocillium lilacinum）。對其生物學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)，該菌最佳培養(yǎng)溫度為30℃、適宜pH 值為5.0～9.0；可利用多種不同碳源、氮源，以磷酸二氫銨為氮源、麥芽糖為碳源時最有利于菌絲生長，以蛋白胨為氮源、蔗糖為碳源時產(chǎn)蛋白酶活性最高，以硝酸銨為氮源、可溶性淀粉為碳源時幾丁質(zhì)酶活性最高。該菌株所產(chǎn)蛋白酶和幾丁質(zhì)酶活性較高，具有一定的生物防治潛力。