可口革囊星蟲體腔液多糖堿提工藝優(yōu)化及其抗氧化性研究

陸伊俏，池海波, ，厲桂寧，陳 纖，邱家港，余 輝，方旭波，陳小娥

（1.浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江舟山 316000；2.浙江國(guó)際海運(yùn)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江舟山 316000）

可口革囊星蟲（Phasolosma esculenta），屬于星蟲動(dòng)物門（Sipuncula），革囊星蟲綱（Pha-scolosomatidea），革囊星蟲目（Phascoloso-maliformes），革囊星蟲科（Phascolosomati-dae），俗稱海泥蟲、海丁、土筍等，是一種重要的海洋經(jīng)濟(jì)無脊椎動(dòng)物，廣泛分布于我國(guó)東南沿海廣東、海南島、福建和浙江等地[1?2]，具有滋陰、補(bǔ)腎、去火的食療作用，被譽(yù)為“動(dòng)物人參”、“海冬蟲夏草”。在福建，可口革囊星蟲體壁為特色傳統(tǒng)風(fēng)味小吃—“土筍凍”的原材料，味美甘鮮，深受消費(fèi)者喜愛。但是，作為加工副產(chǎn)物的星蟲體腔液，長(zhǎng)期以來一直被隨意廢棄，未得到合理利用。

研究表明，星蟲含有豐富的蛋白質(zhì)、微量元素等多種活性物質(zhì)，具有延緩衰老、抗氧化、抗疲勞、耐缺氧等功效[3?7]，如沈先榮等[8]報(bào)道方格星蟲提取物能顯著延長(zhǎng)果蠅的壽命，具有明顯延緩衰老的作用；鄭志鴻等[9]發(fā)現(xiàn)方格星蟲酶解物可縮短止血時(shí)間，增進(jìn)膠原蛋白沉積，具有促進(jìn)傷口愈合的功效。Yang 等[10]發(fā)現(xiàn)從可口革囊星蟲體壁提取的酶解寡糖具有抗炎和抗氧化功效，可提高大腸桿菌誘導(dǎo)的敗血癥小鼠的抵抗能力。實(shí)驗(yàn)測(cè)得可口革囊星蟲體壁、內(nèi)臟、體腔液分別約占原料濕重的25%、15%、60%，目前對(duì)其體壁研究較多，而關(guān)于可口革囊星蟲體腔液中的多糖活性成分則鮮有報(bào)道，尚待深入研究?？煽诟锬倚窍x多糖的提取方法主要有堿浸提法和酶解法等，劉玉明等[11]研究發(fā)現(xiàn)堿法提取工藝得率最高，優(yōu)于酶解法，且堿浸提法對(duì)設(shè)備要求低、方法簡(jiǎn)便，方案成熟，能夠準(zhǔn)確、快速及穩(wěn)定提取多糖。同時(shí)，堿性溶液有利于酸性多糖在提取中快速析出，不但可以提高多糖得率，而且可以縮短提取時(shí)間[12]。本文從提高海洋資源綜合利用價(jià)值、開發(fā)新型海洋生物功能物質(zhì)角度出發(fā)，以可口革囊星蟲加工過程的副產(chǎn)物——體腔液為原料，提取其中的活性多糖，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化堿提可口革囊星蟲體腔液多糖工藝參數(shù)，以總還原力、DPPH 清除率以及羥基（·OH）自由基清除率這三個(gè)抗氧化性檢測(cè)指標(biāo)，對(duì)多糖成分進(jìn)行抗氧化性評(píng)價(jià)，用高效液相色譜法測(cè)定多糖的單糖組成，并利用紅外光譜對(duì)多糖成分進(jìn)行初步分析，為可口革囊星蟲體腔液活性多糖的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

可口革囊星蟲 福建夏蒲星蟲養(yǎng)殖戶；十二烷基硫酸鈉（SDS） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH） 梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；鐵氰化鉀、L(+)-抗壞血酸、水楊酸等試劑 分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

SM800 酶標(biāo)儀 上海永創(chuàng)生物工程有限公司；5804R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)艾本德股份公司；LGJ-10C 冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；iCAN 9 傅里葉紅外光譜儀 天津市能譜科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 可口革囊星蟲體腔液營(yíng)養(yǎng)成分分析 水分的測(cè)定參照GB5009.3-2016 直接干燥法[13]；粗蛋白質(zhì)的測(cè)定參照GB5009.5-2016 凱氏定氮法[14]；粗脂肪的測(cè)定參照GB5009.6-2016 索氏抽提法[15]；灰分的測(cè)定參照GB5009.4-2016—550 ℃灼燒法[16]。

1.2.2 可口革囊星蟲體腔液多糖的提取

1.2.2.1 堿浸提法提取多糖 將可口革囊星蟲解剖分為體壁、體腔液、內(nèi)臟三部分。體腔液用組織勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿，加入一定質(zhì)量濃度的氫氧化鈉溶液，恒溫水浴浸提一定時(shí)間，酸中和后過濾，濾渣反復(fù)浸提多次，合并濾液。上清液加乙醇至終濃度為70%，4 ℃沉淀過夜后于9000 r/min、4 ℃條件下冷凍離心，沉淀即為可口革囊星蟲體腔液多糖[17?18]。將所得沉淀干燥并進(jìn)行稱量并計(jì)算粗多糖得率，保存于4 ℃冰箱中備用。

1.2.2.2 總糖含量測(cè)定 采用苯酚-硫酸法測(cè)定體腔液多糖中總糖含量[19?20]。以葡萄糖為對(duì)照品，分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL，用蒸餾水補(bǔ)充至2 mL，加入6%的苯酚溶液1.0 mL，混勻，迅速加5.0 mL 濃硫酸，室溫放置30 min，于490 nm 處測(cè)定吸光度，以葡萄糖濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=2.7657x+0.0234，決定系數(shù)R2=0.995）。取同濃度可口革囊星蟲體腔液多糖樣品，按照上述方法測(cè)定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，得到該濃度粗多糖中對(duì)應(yīng)的總糖含量。根據(jù)下式計(jì)算單位質(zhì)量星蟲多糖所含總糖含量：

1.2.2.3 正交試驗(yàn) 在前期單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以多糖得率為考察指標(biāo)，選擇提取溫度（A），堿提時(shí)間（B）和NaOH 質(zhì)量濃度（C）3 個(gè)因素進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)。試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal experiment

1.2.3 可口革囊星蟲多糖體外抗氧化活性分析

1.2.3.1 總還原力測(cè)定 向比色管中添加0.5 mL 濃度梯度（即1、5、10、15、20、25 mg/mL）樣品溶液，0.5 mL 95%乙醇，5 mL 水，1.5 mL 1 mol/L 鹽酸，1.5 mL 鐵氰化物溶液（1%），0.5 mL 十二烷基硫酸鈉（1%），最后添加0.5 mL 氯化鐵（0.2%），以使最終體積為10 mL。將混合物在50 ℃水浴中培養(yǎng)20 min，冷卻至室溫，溶液的顏色穩(wěn)定至少30 min，在試劑空白處測(cè)量750 nm（A750nm）時(shí)吸光度[21?22]。以相同濃度梯度Vc 作陽性對(duì)照?？傔€原力計(jì)算公式為：

式中，A1為樣品組吸光度；A2為空白組（即不加氯化鐵顯色劑）的吸光度；A0為對(duì)照組（即樣品換成水）吸光度。

1.2.3.2 DPPH 自由基清除活性測(cè)定 將不同濃度（即1、5、10、15、20、25 mg/mL）的多糖溶液與1 mL 含有DPPH 自由基的甲醇溶液混合，得到DPPH的最終濃度為0.2 mmol/L，劇烈搖動(dòng)混合物并靜置30 min，在517 nm 處測(cè)定吸光度[23?24]。以相同濃度梯度Vc 作陽性對(duì)照。DPPH 清除率的計(jì)算公式為：

式中，A0為對(duì)照物的吸光度；A1為樣品的吸光度。

1.2.3.3 羥基自由基（·OH）清除活性測(cè)定 反應(yīng)混合物（3.0 mL）含有1.0 mL 1.5 mmol/L 硫酸亞鐵、0.7 mL 6 mmol/L 過氧化氫、0.3 mL 20 mmol/L 水楊酸和不同濃度的多糖溶液（即1、5、10、15、20、25 mg/mL）。在37 ℃孵育1 h 后，在562 nm 處測(cè)定羥基水楊酸絡(luò)合物的吸光度[23,25?26]。以相同濃度梯度Vc 作陽性對(duì)照。羥基水楊酸配合物的清除活性計(jì)算公式如下：

式中，A0為對(duì)照物（不含多糖）的吸光度；A1為含有多糖時(shí)的吸光度；A2為不含水楊酸鈉的吸光度。

1.2.4 單糖組成測(cè)定 稱取1.0 mg 可口革囊星蟲體腔液多糖樣品溶于0.5 mL 2 mol/L TFA（三氟乙酸）溶液中，于120 ℃水解2 h 后，置于氮吹儀下干燥，除去TFA。稱取150 μL 1 mg/mL的甘露糖（Man）、葡萄糖醛酸（GlcA）、鼠李糖（Rha）、半乳糖醛酸（GalA）、葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）、木糖（Xyl）、阿拉伯糖（Ara）和巖藻糖（Fuc）標(biāo)準(zhǔn)品，得到標(biāo)準(zhǔn)品混合液，置于酸水解小瓶中備用。將樣品水解產(chǎn)物及九種標(biāo)準(zhǔn)品于PMP（1,3,5-吡唑酮）中70 ℃水浴鍋進(jìn)行柱前衍生化反應(yīng)30 min，將衍生化的溶液進(jìn)行HPLC 檢測(cè)。HPLC 分析方法：采用Agilent 1260 Infinity HPLC 系統(tǒng)，Thermo ODS-2 C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 mm），柱溫25 ℃，流速為1.0 mL/min[27]。

1.2.5 紅外光譜分析 稱取星蟲體腔液多糖約0.0010 g，在紅外燈下用KBr 進(jìn)行研磨并壓片，用iCAN 9 傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行分析。掃描次數(shù)為32 次，分辨率為4，掃描范圍400～4000 cm?1[28?29]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21.0 檢驗(yàn)試驗(yàn)數(shù)據(jù)差異性，制圖采用Origin 2019 軟件，方差分析采用Duncan 法進(jìn)行多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 可口革囊星蟲體腔液營(yíng)養(yǎng)成分分析

對(duì)可口革囊星蟲的體腔液營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行分析，由表2 可知，可口革囊星蟲體腔液的主要成分為水，其含水量高達(dá)90.06%，徐艷等[30]研究發(fā)現(xiàn)方格星蟲體腔液的含水量為96.69%，兩者結(jié)果基本一致?？煽诟锬倚窍x體腔液除去水分后，總糖、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)和脂肪的含量分別為17.20%、60.97%、13.98%和7.85%，可知星蟲體腔液是一種多糖含量較高的優(yōu)質(zhì)動(dòng)物資源。董蘭芳等[31]研究發(fā)現(xiàn)可口革囊星蟲成蟲體壁干品總糖含量為5.26%，與牛改改等[32]測(cè)得的方格星蟲體壁干品總糖含量相近（5.68%）。相比于星蟲體壁，可口革囊星蟲體腔液干品中的總糖含量更高，因此可作為多糖提取的一種原料。

表2 可口革囊星蟲體腔液基本成分表Table 2 Basic components of the coelomic fluid of Phascoloma esculenta

2.2 可口革囊星蟲體腔液多糖提取正交試驗(yàn)結(jié)果

可口革囊星蟲體腔液多糖提取正交試驗(yàn)結(jié)果見表3，從表3 可知三個(gè)因素對(duì)多糖得率大小的影響程度為A（提取溫度）>B（堿提時(shí)間）>C（NaOH 質(zhì)量濃度）。結(jié)合表4 可知，提取溫度、堿提時(shí)間以及NaOH 質(zhì)量濃度對(duì)可口革囊星蟲體腔液多糖的得率影響均不顯著（P>0.05）。相對(duì)來說，提取溫度（A）是影響星蟲體腔液多糖得率的最主要因素，堿提時(shí)間和NaOH 質(zhì)量濃度對(duì)星蟲體腔液多糖提取影響相近，但在不同水平上星蟲體腔液多糖得率均有較大差異。多糖得率越高，提取效果越好，比較K 值大小可以得知可口革囊星蟲體腔液多糖得率最優(yōu)組合為A1B2C2，即提取溫度50 ℃、堿提時(shí)間3 h、NaOH 質(zhì)量濃度1.5%。按照優(yōu)化工藝進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，平行3 次?？煽诟锬倚窍x體腔液多糖得率為0.92%，說明此方法穩(wěn)定，為最佳工藝。苯酚-硫酸法測(cè)得總糖含量為75.45%。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal test

表4 方差分析結(jié)果Table 4 Results of variance analysis

2.3 可口革囊星蟲體腔液多糖抗氧化性活性

2.3.1 總還原力 總還原力是評(píng)估抗氧化劑活性的一個(gè)重要指標(biāo)。樣品還原能力越強(qiáng)，吸光值就越大[33]。由圖1 可知，可口革囊星蟲體腔液多糖總還原力隨質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，半數(shù)清除濃度（IC50）為2.976 mg/mL，Vc的半數(shù)清除濃度（IC50）為0.048 mg/mL，相較于Vc 該多糖的總還原力較弱。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為10 mg/mL 時(shí)，總還原力大小為82.29%，高于同濃度烏賊墨多糖的總還原力（57.43%）[34]。以上結(jié)果顯示，可口革囊星蟲體腔液多糖具有良好的抗氧化性。

圖1 可口革囊星蟲體腔液多糖總還原力Fig.1 Total reducing power of polysaccharides from the coelomic fluid of Phascoloma esculenta

2.3.2 DPPH 自由基清除活性 DPPH 是一種穩(wěn)定的自由基，常用于測(cè)定天然化合物的自由基清除活性。在自由基形式下，DPPH 在517 nm 處吸收，但在使用抗氧化劑還原后，由于其非自由基形式DPPH–H的形成，其吸收減少[23]。因此，在存在供氫抗氧化劑的情況下，自由基清除活性可被監(jiān)測(cè)為DPPH 溶液吸光度的降低。

圖2 顯示了可口革囊星蟲體腔液多糖的DPPH自由基清除能力，該多糖對(duì)DPPH的清除能力隨質(zhì)量濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，具有一定的量效關(guān)系，半數(shù)清除濃度（IC50）為0.567 mg/mL，且當(dāng)質(zhì)量濃度在5～10 mg/mL 時(shí)，清除率迅速升高；Vc的半數(shù)清除濃度（IC50）為0.019 mg/mL，該多糖對(duì)DPPH的清除能力弱于Vc。當(dāng)質(zhì)量濃度為10 mg/mL 時(shí)，體腔液多糖對(duì)DPPH 自由基清除率達(dá)到76.68%，與相同濃度的方格星蟲多糖（76.31%）[35]和酶提可口革囊星蟲多糖（82.22%）[36]對(duì)DPPH的清除率相近，且高于同濃度的擬目烏賊肌肉多糖（68.00%）[37]。這說明可口革囊星蟲體腔液多糖是一種具有清除自由基活性的抗氧化劑，且抗氧化性較強(qiáng)?？赏茰y(cè)可口革囊星蟲體腔液多糖對(duì)DPPH 自由基具有供氫能力，氫與自由基結(jié)合形成穩(wěn)定化合物，從而使反應(yīng)終止。

圖2 可口革囊星蟲體腔液多糖對(duì)DPPH的清除率Fig.2 The clearance rate of polysaccharides from the coelomic fluid of Phascoloma esculenta on DPPH

2.3.3 羥基自由基（·OH）清除活性 羥基自由基在生物系統(tǒng)中是一種非?；钴S的活性物質(zhì)，在自由基病理學(xué)中被認(rèn)為是高度破壞性的物種，能夠破壞活細(xì)胞的生物分子[38]。由圖3 可知，可口革囊星蟲體腔液多糖對(duì)·OH的清除能力隨質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，呈現(xiàn)出濃度依賴性，其半數(shù)清除濃度（IC50）為0.605 mg/mL，較海參臟器多糖HPS1 和HPS2 高（IC50分別為0.89、0.64 mg/mL）[39]，Vc的半數(shù)清除濃度（IC50）為0.011 mg/mL。當(dāng)質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，體腔液多糖對(duì)·OH的清除率達(dá)到65.97%，高于同濃度方格星蟲多糖提取物（56.93%）[35]，與Vc 相比，其清除能力相對(duì)較弱，Vc 濃度為1 mg/mL 時(shí)即可達(dá)到相同清除效果。

圖3 可口革囊星蟲體腔液多糖對(duì)·OH的清除率Fig.3 Elimination rate of ·OH by polysaccharides from the coelomic fluid of Phascoloma esculenta

2.4 可口革囊星蟲體腔液多糖單糖組成

以Glc、Xyl、Man、Gal、Ara、Rha、Fuc、Glc A 和Gal A 為標(biāo)準(zhǔn)單糖樣品，9 種單糖標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰及出峰時(shí)間如圖4 所示。對(duì)可口革囊星蟲體腔液多糖的單糖組成高效液相色譜圖（圖5）分析可知，可口革囊星蟲體腔液多糖的單糖組成較單一，主要為葡萄糖。已有的研究顯示扇貝多糖[40]、乙?；男窍x愛氏?？嗵荹41]、青蛤多糖[42]及近江牡蠣多糖[43]等均由單一葡萄糖構(gòu)成，且均具有抗氧化性?？梢娪蓡我黄咸烟墙M成的多糖發(fā)揮抗氧化性是水生無脊椎動(dòng)物的一種重要特征。目前尚未見關(guān)于可口革囊星蟲體腔液?jiǎn)翁墙M成的報(bào)道，可口革囊星蟲體壁多糖由葡萄糖、甘露糖等8 種單糖組成[36]，方格星蟲體壁多糖由阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖組成[44]，星蟲體壁多糖與體腔液多糖的的單糖組成差異較大，可能與體壁和體腔液在星蟲生物體的功能不同有關(guān)，其具體結(jié)構(gòu)與發(fā)揮功能活性的機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

圖4 混合標(biāo)準(zhǔn)單糖高效液相色譜圖Fig.4 HPLC of mixed standard monosaccharides

圖5 可口革囊星蟲體腔液?jiǎn)翁墙M成高效液相色譜圖Fig.5 HPLC of monosaccharide composition in the coelomic fluid of Phascoloma esculenta

2.5 紅外光譜分析體腔液多糖

由圖6 可知，3420 cm?1附近吸收峰寬而強(qiáng)，是典型的多糖-OH 伸縮振動(dòng)吸收峰；在2930 cm?1處為C-H的伸縮振動(dòng)吸收峰，1650、1420 cm?1代表2 種典型的酰胺峰，前者為氫鍵締合影響導(dǎo)致偏移的酰胺Ⅰ帶，后者為N-H 鍵的面內(nèi)彎曲振動(dòng)的酰胺Ⅱ帶，證明該多糖為糖蛋白綴合物。1160、1080和1020 cm?1這三個(gè)吸收峰的存在證明該多糖具有吡喃糖苷[45]。847 cm?1附近吸收峰表明多糖中α糖苷鍵的特征峰。此外，1020～524 cm?1之間也存在不同程度的吸收，這些峰均可作為可口革囊星蟲體腔液多糖的鑒別特征峰。綜上，可口革囊星蟲體腔液多糖是含有乙酰氨基和吡喃環(huán)，以α糖苷鍵連接的多糖。這與李妍妍等[46]研究結(jié)論一致。

圖6 可口革囊星蟲體腔液多糖紅外光譜圖Fig.6 Infrared spectra of polysaccharides from the coelomic fluid of Phascoloma esculenta

3 結(jié)論

本研究采用堿浸提法從可口革囊星蟲體腔液中提取活性多糖，利用正交試驗(yàn)得到最佳提取工藝：提取溫度50 ℃、堿提時(shí)間3 h、NaOH 質(zhì)量濃度1.5%，在此工藝下，體腔液多糖得率最高為0.92%。多糖在體外抗氧化活性檢測(cè)中展現(xiàn)出良好的抗氧化作用，其總還原力的半數(shù)清除濃度（IC50）為2.976 mg/mL，對(duì)DPPH 和羥基自由基也有很好的清除作用，它們的半數(shù)清除濃度（IC50）分別為0.567、0.605 mg/mL。該多糖主要由葡萄糖組成，在傅里葉紅外光譜下呈現(xiàn)多個(gè)多糖特征吸收峰，其含有乙酰氨基和吡喃環(huán)，以α-糖苷鍵連接，為典型的動(dòng)物多糖。本研究提供了一種提取可口革囊星蟲體腔液多糖的方法，測(cè)定所提多糖的抗氧化性及其單糖組成，為工業(yè)上更廣泛開發(fā)利用可口革囊星蟲體腔液多糖提供科學(xué)依據(jù)。但本研究只得到可口革囊星蟲體腔液多糖的粗提物，對(duì)可口革囊星蟲體腔液多糖的純化及其結(jié)構(gòu)方面的研究和相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)尚待更進(jìn)一步研究。