DNA遺傳標(biāo)記在中藥鑒定中的應(yīng)用

秦曉紅

【摘要】目的總結(jié)生物測(cè)定分子遺傳標(biāo)記技術(shù)在中藥材鑒定領(lǐng)域的應(yīng)用。方法查閱、歸納、整理近年來(lái)國(guó)內(nèi)外有關(guān)中藥生物測(cè)定的研究文獻(xiàn)。結(jié)果DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)具有微量、快速、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確可靠、對(duì)樣本要求較低的特點(diǎn)。結(jié)論DNA分子鑒定對(duì)中藥種類(lèi)與資源等方面的研究起到重要作用。

【關(guān)鍵詞】DNA分子遺傳標(biāo)記；PCR；RAPD

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2014.01.574文章編號(hào)：1004-7484（2014）-01-0472-01

中藥治療疾病在中國(guó)已有幾千年歷史，特別是治療慢性、消耗性疾病具有獨(dú)特的、西藥不可替代的作用。中藥品種繁多，同一種中藥，由于物種及產(chǎn)地的不同，其質(zhì)量差異較大，而質(zhì)量（品質(zhì)）與中醫(yī)臨床療效密切相關(guān)。因此，為了保證臨床用藥的安全及質(zhì)量和療效的穩(wěn)定，準(zhǔn)確、迅速、簡(jiǎn)捷的中藥鑒定方法的建立已成為當(dāng)務(wù)之急。中藥鑒別所依據(jù)的遺傳標(biāo)記主要有形態(tài)標(biāo)記、生化標(biāo)記（包括免疫學(xué)標(biāo)記）、組織細(xì)胞標(biāo)記。這些標(biāo)記都是基因表達(dá)的產(chǎn)物，易受生理狀態(tài)、生長(zhǎng)環(huán)境、貯藏加工、生長(zhǎng)期、品種等的影響，且標(biāo)記數(shù)目有限，急需新的遺傳標(biāo)記技術(shù)。自從Bostein和White等于1980年利用RFLP作為遺傳標(biāo)記，開(kāi)創(chuàng)了直接應(yīng)用DNA多態(tài)性發(fā)展遺傳標(biāo)記的新階段。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，DNA分子標(biāo)記的新技術(shù)不斷涌現(xiàn)，DNA分子標(biāo)記技術(shù)在中藥的應(yīng)用報(bào)道逐漸增多。由于DNA分子標(biāo)記技術(shù)具有快速、微量、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確可靠等特點(diǎn)，且不受生育階段、供試部位、環(huán)境條件、貯藏等因素的影響，在中藥研究中展示了廣闊的應(yīng)用前景。

1DNA遺傳標(biāo)記的應(yīng)用范圍

1.1鑒定植物種類(lèi)隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于植物品種的整理研究。我國(guó)南方部分省區(qū)有多種菊科不同屬的植物如地膽草、一點(diǎn)紅、苦荬菜、毛大子草、山萵苣、苦苣菜以“土公英”混作蒲公英使用。曹暉等[1]利用Ap-PCR和RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)蒲公英及六種土公英混淆品進(jìn)行了DNA指紋鑒別研究，結(jié)果顯示它們的DNA指紋圖譜存在明顯差異，利用這種差異可以從分子水平上鑒別蒲公英及其混淆品此外，淫洋藿屬八種植物、云南八種木藍(lán)屬植物、山冬麥屬四種植物等用RAPD技術(shù)也得到了準(zhǔn)確地鑒定。

1.2鑒定藥材道地性道地藥材的優(yōu)良品質(zhì)是道地藥材基因型與特定的環(huán)境條件長(zhǎng)期作用的結(jié)果，特定的基因產(chǎn)生特定的酶，進(jìn)而調(diào)控次生代謝產(chǎn)物等有效成分的產(chǎn)生，因而特定的基因是藥材道地性形成的關(guān)鍵。由于道地藥材與非道地藥材來(lái)源于相同或相近的物種種類(lèi)，在形態(tài)、生藥性狀及化學(xué)成分等特征上也常表現(xiàn)出高度的相似性，因而采用傳統(tǒng)的方法進(jìn)行道地藥材的鑒別是十分困難的，具有很大的主觀性。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，作為現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)重要手段的RAPD技術(shù)的應(yīng)用，使從分子水平進(jìn)行道地藥材的快速、準(zhǔn)確鑒定成為可能。近年來(lái)應(yīng)用RAPD技術(shù)進(jìn)行道地藥材的鑒定已取得了一些有價(jià)值的研究成果，例如枸杞、姜黃、溪黃草、當(dāng)歸、金銀花等藥用植物道地性的研究。枸杞主產(chǎn)于寧夏、甘肅、青海、內(nèi)蒙等地，以寧夏產(chǎn)為最佳道地藥材。李軍等[2]比較了來(lái)自寧夏和內(nèi)蒙兩地的枸杞的RAPD指紋，結(jié)果表明，RAPD方法可以很好地鑒定不同來(lái)源的枸杞材料。王朝暉[3]等研究了4個(gè)來(lái)源的穿心蓮RAPD圖譜。結(jié)果各穿心蓮RAPD圖譜之間可見(jiàn)差異條帶，表明不同產(chǎn)地的穿心蓮基因確已發(fā)生了微小的變異，這種變異可能是導(dǎo)致不同產(chǎn)地穿心蓮質(zhì)量差異的基礎(chǔ)之一。

2DNA遺傳標(biāo)記的類(lèi)別

根據(jù)目的基因所在細(xì)胞器的不同可分為核DNA標(biāo)記、線粒體DNA標(biāo)記和葉綠體DNA標(biāo)記。線粒體DNA標(biāo)記主要用于動(dòng)物的起源進(jìn)化、親緣關(guān)系、遺傳變異、物種鑒別等研究；核DNA和葉綠體DNA分子標(biāo)記主要存在于高等植物中，尤以核DNA分子標(biāo)記的應(yīng)用最多。

DNA分子標(biāo)記是近年來(lái)隨著核酸分子技術(shù)的發(fā)展而研發(fā)的，在基因定位、品種鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建等方面得到了廣泛的應(yīng)用。根據(jù)DNA分子標(biāo)記所采用的核心技術(shù)大體上可分為兩大類(lèi)。一是以PCR為基礎(chǔ)的DNA分子標(biāo)記技術(shù)，另一類(lèi)是以分子雜交（southern雜交）為基礎(chǔ)的DNA分子標(biāo)記技術(shù)。

基于PCR技術(shù)的DNA分子標(biāo)記鑒別的研究方法依據(jù)分析對(duì)象可分為兩類(lèi)：其一是采用檢測(cè)基因組DNA的多態(tài)，如隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA、AP-PCR、擴(kuò)增內(nèi)切酶片斷多態(tài)性等方法，又稱(chēng)為PCR-DNA指紋法；其二是檢測(cè)特定片斷DNA的多態(tài)，即以特定的基因（或短片斷的DNA）為研究對(duì)象，如PCR產(chǎn)物的限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性、等位基因特異PCR、DNA直接測(cè)序等方法。

3對(duì)PCR的影響因素

3.1植物核DNA的提取目前多采用CTAB法。CTAB是一種去污劑。它能跟核酸形成復(fù)合物，這些復(fù)合物在高鹽溶液（0.7mol/lNacl）中可溶并且穩(wěn)定存在，但如果降低鹽的濃度（0.3mol/INacl），CTAB與核酸的復(fù)合物就會(huì)因溶解度降低而沉淀出來(lái)，但大部分蛋白及多糖仍溶于液中。

3.2模板純度各濃度等對(duì)PCR的影響王培訓(xùn)等[4]以各地產(chǎn)西洋參為研究對(duì)象，對(duì)影響中藥材隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）的若干問(wèn)題進(jìn)行了探討。研究發(fā)現(xiàn)，中藥材DNA模板的降解程度、純度、濃度，酶的濃度，M92+濃度以及循環(huán)參數(shù)等諸多因素皆會(huì)不同程度的影響擴(kuò)增結(jié)果，同時(shí)推薦一個(gè)較為適用的循環(huán)參數(shù)。模板純度對(duì)PCR的影響：分子生物學(xué)的各類(lèi)研究，通常需獲得高純度的DNA，然而在中藥飄揚(yáng)的RAPD研究中，當(dāng)模板中含有一定量的雜質(zhì)時(shí)，并不影響擴(kuò)增結(jié)果。模板濃度對(duì)PCR的影響：對(duì)PCR有一定影響，但在一定范圍內(nèi)其擴(kuò)增結(jié)果基本相同。反應(yīng)介質(zhì)：BSA能影響PCR擴(kuò)增結(jié)果，不加BSA雖能進(jìn)行的增，但其條帶數(shù)少于加少BSA的反應(yīng)。BSA濃度在0.5-2.0g/l其條帶基本一致。此外根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，中藥材的RAPD擴(kuò)增Tap酶通常須1.5U/25uL以上方能進(jìn)行較好擴(kuò)增，這可能與各廠家Tap酶活性和我們提取的模板中帶有某些抑制成分有關(guān)。Mg2+、dNTP對(duì)擴(kuò)增結(jié)果影響不大，主要是對(duì)弱帶的影響。

3.3引物的篩選問(wèn)題商品中藥材基因組DNA降解程度差別較大，但合適的引物可得到基本一致的DNA指紋圖譜。通常RAPD的產(chǎn)物在200.3000bp形成指紋圖，但能使中藥材擴(kuò)增出200.1500bp條帶的引物較為合適，因?yàn)樵诖朔秶鷥?nèi)，不同時(shí)間樣品易出現(xiàn)相同條帶即重現(xiàn)性好。

3.4擴(kuò)增條件在其他參數(shù)條件相同時(shí)，樣品DNA降解相對(duì)較為重的模板，在用某些引物擴(kuò)增時(shí)，反應(yīng)循環(huán)數(shù)要適應(yīng)增加，才能得到有效擴(kuò)增。

3.5污染由于PCR的強(qiáng)大功能與檢測(cè)的靈敏性，極微量的污染便可導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。故每次PCR反應(yīng)一定要設(shè)立陰性對(duì)照孔，檢測(cè)污染情況。

4小結(jié)與展望

中藥走向世界，質(zhì)量保證是一個(gè)重要的方面。DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)在中藥鑒定及其相關(guān)研究方面具有獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)和廣闊的應(yīng)用前景，但目前尚處于探索階段。各種DNA分子遺傳技術(shù)存在一定的局限性，有待進(jìn)一步規(guī)范和完善。利用DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)，開(kāi)發(fā)有關(guān)藥用動(dòng)物遺傳背景與化學(xué)成分相關(guān)性的研究，實(shí)現(xiàn)中藥品種——質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化、基因工程生產(chǎn)天然活性成分尋找和擴(kuò)大新藥源；開(kāi)發(fā)中藥重要性狀包括品質(zhì)、產(chǎn)量和抗性的分子標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)中藥材分子育種及品質(zhì)人工調(diào)控，將是中藥分子鑒定學(xué)的挑戰(zhàn)又是現(xiàn)實(shí)意義的大課題。

參考文獻(xiàn)

[1]曹暉，畢培曦，邵鵬柱.香港市售蒲公英及其混淆品蒲公英的DNA指紋鑒別研究[J].中國(guó)中藥雜志，1997，22（4）：197.

[2]李軍，郭晏海，秦雪梅.DNA隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性分析技術(shù)在枸杞道地藥材鑒定中的應(yīng)用[J].中醫(yī)藥研究，2002，18（3）：48-49.

[3]王朝暉，李勁平，王培訓(xùn).不同產(chǎn)地穿心蓮藥材的RAPD鑒別初步研究[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2006，12（5）：4-5，8.

[4]王培訓(xùn)，黃豐，等.商品西洋參DNA指紋圖譜鑒別[J].中藥新藥與臨床藥理，1999，10（6）：367.