酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測豬肉中鹽酸克倫特羅

薛金英

鹽酸克倫特羅（俗稱瘦肉精）為一種人工合成的β-腎上腺素興奮劑，具有擴張支氣管的作用，常用來防治哮喘、肺氣腫等肺部疾病。當(dāng)其應(yīng)用量達到治療量的5～10倍時，其有能量重分配作用，可使肌肉合成增加，脂肪沉積減少，因此俗稱為“瘦肉精”。在畜牧業(yè)生產(chǎn)中一些非法使用者將其作為一種和生長促進劑添加到動物飼料中，用以改善胴體的品質(zhì)，同時也造成食品中鹽酸克倫特羅（瘦肉精）的殘留。當(dāng)人們食用鹽酸克倫特羅殘留的產(chǎn)品后會出現(xiàn)一系列的中毒癥狀。動物源性食品藥物殘留問題逐漸引起人們的重視。本法用于定量、定性檢測豬肉中鹽酸克倫特羅的殘留。

1試驗原理

采用間接競爭ELISA法，在微孔板上包被抗鹽酸克倫特羅檢測抗原，樣品中的鹽酸克倫特羅將和酶標(biāo)板上的鹽酸克倫特羅檢測抗原競爭結(jié)合鹽酸克倫特羅抗體，鹽酸克倫特羅檢測抗原結(jié)合的鹽酸克倫特羅抗體再與同時加入的酶標(biāo)二抗結(jié)合，洗滌后，用TMB底物系統(tǒng)顯色，微孔板吸光值與樣品中鹽酸克倫特羅含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以濃度比值即可得出鹽酸克倫特羅在樣品的實際含量。

2試驗方法（稀釋倍數(shù)為4倍）

稱取1.0 g（±0.05 g）均質(zhì)樣品于50 mL聚苯乙烯離心管中，加入1 mL 0.1 M鹽酸，再加入2 mL提取工作液，充分振蕩混勻5 min，4 000 rpm（20～25℃）離心10 min。取1 mL上清液加入約25 μL 1 M 氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6.5～7.5之間，充分振蕩混勻，取50 μL用于分析。如果上層中存在白色脂肪層，取樣時應(yīng)避開。

試劑準(zhǔn)備：將10×濃縮洗滌液和蒸餾水（或去離子水）按1∶9充分混勻，即為1×洗滌液。

編號：將鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測樣品對應(yīng)微孔按序編號，建議每個標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測樣品均做重復(fù)孔。

加樣：加入標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品50 μL，然后每孔分別加入鹽酸克倫特羅酶標(biāo)二抗50 μL和鹽酸克倫特羅抗體溶液50 μL。

溫育：輕輕振蕩混勻，用封板膜封板后置于室溫（20～25℃）反應(yīng)30 min。

洗滌：小心揭開封板膜，每孔加入1×洗滌液250 μL洗滌微孔板，連續(xù)洗板3次，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭戳破）。

顯色：將底物溶液A和底物溶液B按1∶1混合，振蕩混勻，每孔加入100 μL，室溫（20～25℃）避光顯色15 min。

測定：每孔加入終止液50 μL，輕輕振蕩混勻，5 min內(nèi)測定450 nm處吸光度值。

3結(jié)果判定

計算B/B0 ：所獲得的標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測樣品的吸光度值除以0號標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。

式中：B ∶ 標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測樣品溶液的吸光度值，B0 ∶ 0號標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品中鹽酸克倫特羅濃度：以鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為X軸，對應(yīng)的百分吸光度值為Y軸，在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。相對應(yīng)每一個樣品的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。也可以用回歸方程法，計算出樣品中鹽酸克倫特羅的濃度。

鹽酸克倫特羅實際含量（μg/kg）=C×D

式中：C：稀釋后樣品提取液中鹽酸克倫特羅含量（μg/L），D：樣品稀釋倍數(shù)

注：為獲得樣品中鹽酸克倫特羅的實際含量（μg/kg），從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出的濃度值應(yīng)當(dāng)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

4結(jié)論

本試劑盒靈敏度為0.1 μg/L，樣品最低檢測限為0.4 μg/kg，回收率一般在80%～100%之間，為確保結(jié)果準(zhǔn)確，試驗過程中應(yīng)注意以下問題：

試劑盒保存于2～8℃，不能冷凍，未用的微孔板放回原鋁箔袋密封后2～8℃存放，并盡快使用。底物溶液要避光保存。使用之前，將樣品及所需試劑的溫度平衡至20～25℃，否則可能導(dǎo)致后面檢測吸光度值偏低。試劑使用完后應(yīng)立即放回2～8℃冰箱。不要使用過期的試劑盒，不同批號試劑不能混用；洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作，如果洗板后出現(xiàn)板孔干燥，會導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)曲線線性不好。底物溶液如果變藍表示已經(jīng)變質(zhì)，不能使用。0號標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值< 0.6時，表示試劑盒已經(jīng)變質(zhì)，不能使用。反應(yīng)終止液為2 M硫酸，應(yīng)避免與皮膚和衣物接觸。（編輯：何芳）